提取紫杉醇初分离工艺的研究

紫杉醇（paclitaxel，商品名Taxol）是当今一种重要的抗癌新药。早在1971年，Wani等就从红豆杉树皮中发现并分离出了这种物质。由于它特异的临床抗癌疗效，1992年被美国FAD批准为治疗晚期乳腺癌的特效药而上市。然而，在实际药物生产中，紫杉醇的大规模制备仍存在许多问题。首先，紫杉醇来源匮乏，其主要存在于红豆杉树皮和针叶中，其次，紫杉醇在植物中含量极低，大约为0.010%~0.013%，而紫杉醇与其它紫杉烷化合物在化学结构和极性等方面又极为相似，要将它们完全分离困难很大。关于紫杉醇提取分离方法，已有过不少的研究。其中以液-液萃取应用最为广泛，在文献报道的每一种工艺中，几乎都采用过它。Willey等和Mattina等在测定样品中紫杉醇浓度时，选择了固相萃取作为HPLC分析的预处理。以分子间吸附为机理的硅胶柱层析，是制备紫杉醇最常用的方法之一。1984年，Senilh等曾采用氧化铝柱层析处理红豆杉浸膏，但所报道的分离效果不是太理想。1995年，Matysik等曾用制备薄层层析来少量获取紫杉醇。本研究的目的，在于寻找一条切实可行的工艺路线，最大程度地提高紫杉醇的回收率，以充分利用有限的红豆杉资源；采用一些高效、经济的提取分离方法，减少过程步骤，快速、简捷地提取出紫杉醇。1材料方法1.1材料红豆杉树皮提取浸膏，云南张峰植物加工厂；紫杉醇对照品，纯度大于95%，Sigma；固相萃取柱（C18填料，10ml），大连化学物理研究所；GF254硅胶和粗孔硅胶（100~140目），青岛海洋化工厂；层析氧化铝（200~300目），上海新诚精细化学品有限公司。DU-7紫外/可见分光光度计及FL-750HPLC仪，Beckman公司；XZ-6A旋转蒸发器，北京科龙仪器公司；常压层析系统，Pharmacia公司。1.2方法1.2.1液-液萃取称取红豆杉树皮浸膏于锥形瓶中，加CH2Cl2（浸膏CH2Cl2的重量比为1：50），充分溶解，再加入与CH2Cl2等量的水，充分混合后静置分层，分液回收有机相，弃水相。有机相再加水萃取，重复三次。将有机相中的CH2Cl2减压蒸出回收，所得固相物溶解于甲醇中，用HPLC作定性定量分析。1.2.2固相萃取固相萃取过程包括四个步骤，即固定相活化、样品上柱、淋洗、样品的洗脱。全过程将速度稳定控制在5~8ml/min。固定相活化：取乙酸乙酯10ml加入柱中，抽空。依资助加入甲醇10ml和0.01mol/L(pH5.0)的乙酸铵缓冲液10ml（乙酸铵水溶液），将液面维持在胶层上1~2mm。上样及淋洗：将样品溶于80%~90%的甲醇乙酸铵溶液中，取0.5ml加入柱中，抽空。依次用0.01mol/L的乙酸铵溶液10ml、50%的甲醇乙酸铵溶液淋洗，抽空。紫杉醇的洗脱：在淋洗好的柱子中加入80%的甲醇乙酸铵溶液10ml，收集洗脱液，减压蒸发。从洗脱液蒸发所得的固体物中取样，溶解于甲醇，作HPLC定性定量分析。1.2.3硅胶柱层析硅胶用CHCl2浸泡，超声波脱气5min，重力沉降法装柱（15mm-×260mm），用CHCl2充分洗出硅胶中的杂质至柱床透明。样品溶解于CHCl3后上柱，再用CHCl3充分洗去未被吸附的杂质，然后用3：97（v/v）的CH3OH：CHCl3进一步洗脱，收集洗脱峰，HPLC测定紫杉醇的浓度和纯度。柱层析过程在常温常压下操作。1.2.4氧化铝柱层析CH3OH、CHCl3用分子筛脱水，层析用氧化铝190℃真空干燥6h后，用脱水CHCl3浸泡，超声波脱气5min，装成15mm×260mm的层析柱。清洗柱后上样，用CHCl3洗去未被吸附的杂质，再用1%的CH3OH、CHCl3（v/v）淋洗，最后用5%的CH3OH溶液洗脱出紫杉醇。HPLC测定其纯度，柱层析过程在常温常压下操作。1.2.5制备薄层层析用GF254硅胶自制100mm×200mm层析薄板，105℃活化0.5h，样品用CH3OH溶解，配成10mg/ml的溶液。毛细管点样，成线状，每板点样量在2mg左右。在对照板中点标准品和样品，用氯仿-甲醇（95：5）展开，254nm紫外光下确定紫杉醇的Rf值。切割并收集制备板上的紫杉醇带，用CH3OH洗脱下硅胶上吸附的紫杉醇，HPLC测定其纯度。1.2.6紫杉醇的定量定性分析采用HPLC对紫杉醇作定性定量分析：4.6mm×250mm的C18柱，检测波长为227nm，等梯度洗脱，流动相为甲醇-乙腈-水（20：32：48），流速1.0ml/min。以紫杉醇标准品为对照，外标法作定量分析。2结果及分析2.1液-液萃取以1：1的二氯甲烷-水对粗品液-液萃取，紫杉醇富集到有机相。实验中发现，有机相与水相的分层速度慢，并有乳化现象。液-液萃取的紫杉醇回收率为94.6%，紫杉醇含量从0.65%提高到1.23%。液-液萃取的缺点在于产生的废水较多。2.2固相萃取用50%的CH3OH洗涤，紫杉醇不会被洗下，而浓度加大到80%，即可将紫杉醇从萃取柱洗脱。样品经一步固相萃取，紫杉醇浓度可提高8.9倍，回收率为100%。与液-液萃取相比较，固相萃取的优点体现在快速、简单、便于自动化。同时，固相萃取的分离效率明显高于液-液萃取。2.3硅胶柱层析紫杉醇在硅胶柱上的保留较强，用CHCl3淋洗时，紫杉醇不被洗出。而用3%的CH3-OH：CHCl3（v/v）洗脱，可分离出两个峰。HPLC分析表明，其中的第二个峰，即图1中峰1为紫杉醇。实验中还发现，在层析流动相中添加0.05%4水时，分离出的紫杉醇纯度有所提高，分离速度也能显著加快。经硅胶柱层析，能获得纯化20倍以上、纯度大于14%、回收率大于98%的紫杉醇。2.4氧化铝柱层析紫杉醇在氧化铝柱上的保留和分离大致相同。用最佳流动相和高活性（即含水量低）的吸附剂分离芳烃异构体，氧化铝柱往往要比硅胶效果好得多。用5%的甲醇洗脱，可将大部分紫杉醇洗出。Carver等认为，氧化铝能使糖基化的紫杉醇转化为紫杉醇，从而增加了紫杉醇的总量，使紫杉醇的回收率可能大于100%。我们的实验也发现了这一现象，这一现象的确切原因还有待于深入探索。2.5制备薄层层析硅胶薄层层析（TLC）原理与硅胶柱层析原理一致。TLC可将样品分离出11条以上的色带，紫杉醇带在薄板的中部（Rf≈0.5），呈现紫红色。应用TLC纯化紫杉醇，一步可将紫杉醇含量从0.65%提高到13.9%，回收率为99.7%。2.6预处理的比较各处理步骤比较如表1。表1中数据可知，以氧化铝柱层析纯化紫杉醇的效率最高。氧化铝介质便宜，能充分利用有限的红豆杉原料，是一可行的纯化紫杉醇方法。其次是硅胶柱层析，浸泡好的硅胶半透明，在玻璃层析柱上能观察到层析进展情况，操作很直观。TLC的优点是设备简单、有机溶剂消耗很少。但TLC处理量较小，工业放大困难。固相萃取的优点体现在简单、便于自动化、能显著减少溶剂的用量。表1预处理步骤对紫杉醇纯化效果的比较-------------------------------------------------------------------------步骤样品量(mg)紫杉醇(mg)纯度(%)回收率(%)纯化倍数粗品22.500.1460.651001液-液萃取11.790.1451.2399.31.9固相萃取2.270.1466.441009.9硅胶柱层析0.980.14414.6398.922.5氧化铝柱层析0.790.20526.3140.540.5薄层层析1.050.14613.9199.721.4-------------------------------------------------------------------------2.7初分离工艺的提出HPLC分析表明，粗品经过氧化铝柱层析处理后，极性比紫杉醇弱的物质基本被除去，而极性比紫杉醇稍强的杂质用正相柱已很难分离。仅经一步正相柱层析，样品中的成分还较复杂，若直接上HPLC制备，必将影响HPLC柱的使用寿命、进料量等。因此，有必要对样品作进一步的处理。较理想的工艺集成是氧化铝正相柱层析处理后采用一步反相层析，即采用一步C18固相萃取，以除去极性比紫杉醇稍强的杂质。实验结果如表2，预处理工艺纯化紫杉醇的纯化倍数达60以上，紫杉醇回收率为135.5%，纯度为42.2%。表2预处理工艺纯化紫杉醇结果--------------------------------------------------------------------------步骤样品量(mg)紫杉醇(mg)纯度(%)回收率(%)纯化倍数粗品85.500.5550.651001氧化铝柱层析2.990.77525.9139.739.8固相萃取1.780.75242.2135.564.9--------------------------------------------------------------------------3结论本工艺主要目的是简便除去紫杉醇类似物及其它生物碱，获得初步纯化的紫杉醇。过程采用价格低谦的氧化铝为层析介质，省略了液-液萃取步骤，简化了分离工艺，提高了分离效率，有利于工业放大。氧化铝柱层析处理云南红豆杉针叶浸膏，紫杉醇的回收率大于140%，这使有限的红豆杉资源能得以充分的利用。采用优化的初分离工艺，从浸膏中有效地分离出了紫杉醇。样品经此初分离工艺处理后，可直接上HPLC制备柱。初分离工艺提取紫杉醇的纯化倍数为64.9，纯度为42.2%。