固态发酵法讲义

固态发酵法第一节概述固态发酵起源于中国，具有几千年的历史。近年来，由于固态发酵具有节水、节能的独特优势，属于清洁生产技术、逐步得到世界各国的重视。因此，本书从全新角度和从发展的观点来讨论固态发酵，以期使人们重新认识固态发酵。本着继承、发展和创新的观点，不仅对固态发酵基础理论进行分析，而且从固态发酵的典型应用过程上来说明。一、固态发酵的内涵一般发酵工艺过程按照培养基物理性状不同，将发酵方式分为两大类：固态发酵和液态发酵。液态发酵主要有表面发酵和深层发酵而一切使用不溶性固体基质来培养微生物的工艺过程，称之为固体基质发酵(so1idsubstratesfermentation)。按照这样的理解，既包括将固体悬浮在液体中的深层发酵，也包括在没有(或几乎没有)游离水的湿固体材料上培养微生物的工艺过程。而对于固态发酵来讲，是指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水不溶性固态基质中，用一种或多种微生物的一个生物反应过程。由于人们对于固态发酵传统的认识是从固体基质开始，它既是微生物生长代谢的碳源能源，又是微生物生长的微环境，上述对于固态发酵的定义难以反映出固态发酵的科学内涵。从生物反应过程的本质考虑，固态发酵是以气相为连续相的生物反应过程，与此相反，液态发酵是以液相为连续相的生物反应过程。从这个定义中可以充分认识固态发酵的特点．以及液态发酵本质的区别（图1.1）。二、固态发酵的特点固态发酵是气体作为生物反应过程中的O2、CO2、热量、营养和产物的传递介质，表现为O2、CO2扩散比较容易，热量传递困难，存在明显的营养梯度，并且无大量有机废水产生。三、固态发酵与液态发酵比较分析固态发酵与液态发酵本质区别是以气相还是以波相为连续相的差异，具体表现是固体发酵基质中游离水的多少。固态发酵中微生物生长在缺乏或几乎缺乏不可见液体水的颗粒之间，在固态发酵系统中，微生物可以从湿的基质颗粒中获得所需的水分。固体发酵基质的含水量可以有效控制在12％~80％之间，大多含水量在60％左右。与固态发酵相反，典型的深层液体发酵的发酵液中台有5％左右的溶质，至少有95％的水。当前发酵工业所使用的主要是深层液态发酵，尽管这种技术已经经过了较长期的使用和研究，但是，它仍然存在着许多难以克服的缺点，需要采用新的技术加以解决。表1.1固态发酵与液态发酵的比较续表1.1第二节固态发酵的分类一、传统固态发酵与现代固态发酵虽然固态发酵与液态发酵相比，具有它独特的优势，但也存在着许多不足。特别是传统固态发酵是发酵工业中古老而又落后工艺的代名词。甚至，在发酵工程或生化工程的教科书中，也很少提到固态发酵。现代发酵技术的关键条件是纯种大规模集约化培养．随着科学技术发展和可持续发展的影响，国内外逐步重视对固态发酵的研究开发，已取得了很大进展。因此，依据固态发酵过程中是否能实现限定微生物纯种培养，分为传统固态发酵与现代固态发酵。现代固态发酵是为了充分发挥固态发酵的优势，针对传统固态发酵存在的问题，使之适应现代生物技术的发展而进行的，可以实现限定微生物的纯种大规模培养。表1.2现代固态发酵与传统固态发酵二、固态发酵的形式1，按微生物的情况和形成的产品条件不同分类固态发酵可以以许多不同的形式进行，按照使用的微生物的情况和形成的产品条件不同，固态发酵可分为自然富集固态发酵、强化微生物混合固态发酵、限定微生物混合固态发酵和单菌固态纯种发酵。自然富集固态发酵是指利用自然界中的微生物，由不断演替的微生物进行的富集混合发酵过程。典型的例子是传统酒曲和酱油、腌莱、烟草发酵、茶叶发酵、青贮、堆肥等。它不需要人工接种微生物，其所需发酵的微生物主要依赖于当地空气和物料中的自然微生物区系，多种微生物演替成最适于生长代谢或共生协作的小生态环境。其微生物富集区系不仅与当地空气和物料中的自然微生物区系有关，而且与小生态环境自然变化密切相关。强化微生物混合固态发酵是指在自然富集固态发酵的基础上，根据人们部分掌握的微生物代谢机制，人为强化接种微生物茵系不明确的富集培养物或特定微生物培养物所进行的混合发酵过程。强化微生物混合固态发酵除应用于沼气发酵、白酒发酵作用外，在石油采收、湿法冶金、食品发酵等领域同样显示其优势。人们在长期的科学研究和生产实践中却不断发现，不少生命活动及其效应是借助于两种以上的生物在同一环境中的共同作用下进行的，甚至是单独不能或只能微弱进行的。例如废物的处理，纤维索和本质素的降解，甲烷的产生和利用等。自然界的微生物没有一种是单独存在的，单靠纯培养很难反映它们的真实活动情况。因此，强化微生物混合固态发酵微生物资源具有非常广阔的应用前景。限定微生物混合固态发酵是在对微生物相互作用和群落认识的基础上，接种混合培养的微生物是已知和确定的，通常使用两种或两种以上经过分离纯化的微生物纯种，同时或先后接种同一灭过茵的培养基中，在无污染条件下进行的固态发酵过程。人类对微生物的利用经历过天然混合培养到纯种培养两个阶段，纯培养技术使得研究者摆脱了多种微生物共存的复杂局面，能够不受干扰地对单一目的菌株进行研究，从而丰富了人们对微生物形态结构、生理和遗传特性的认识。但是，在长期的实验和生产实践中，人们不断地发现很多重要生化过程是单株微生物不能完成或只能微弱地进行的，必须依靠两种或多种微生物共同培养完成。虽然微生物混合培养在很多领域中的作用已得到充分肯定，部分成果己成功应用于实践，但对大多混合菌体系中菌间相互关系和作用机制的研究尚不够深入。因此，目前对于具有协同作用关系的菌株筛选和组合还是一个随机过程的，缺乏有效的理论指导，而且对于已经应用的混合培养体系也不能有效地协调菌间的关系，使其达最佳生态水平，发挥最大效应。这严重地阻碍了混合菌培养的发展和应用。因此，如果从生理、代谢和遗传角度对混合茵间关系和协同作用机制进行深入研究，对混合菌培养的理论和应用都将有巨大的突破。随着混合菌培养在各方面应用研究的深入，人们不再满足于传统的反应模式，已开始引人一些新兴的生物工程技术，使该领域的研究更具活力。采用固定化细胞技术固定混合菌可使反应系统多次使用，降低成本，增加效率，在实际应用中很有意义。利用细胞融合技术和基因工程技术由具有互生或共生关系的微生物构建工程菌，可使工程菌既具有混合培养的功能，又拥有纯培养菌株营养要求单一、生理代谢稳定、易于调控等优点，也是极有前景的研究方向。单菌固态纯种发酵是在纯培养基础上建立起来的，对于选育良种、保持生理活性和代谢过程中的稳定起很大作用。它对于扩大固态发酵的应用范围和潜力的发挥起到非常重要作用，同时，也是固态发酵一个重要方向。2，按固态发酵固相的性质分类根据固态发酵固相的性质，可以把固态发酵分为两种类型。一种是以农作物(如麸皮、豆饼等)为底物的固态发酵方式。这些底物既是固态发酵过程中的固相组成部分，又为微生物生长提供营养，在这里可以称这种发酵为传统固态发酵方式(或固体底物基质固态发酵)。另一种固态发酵方式是以惰性固态载体为固态发酵过程令的固相，微生物生长的营养是吸附在载体上的培养液，称这种发酵方式为惰性载体吸附固态发酵。同体底物基质固态发酵利用的培养基是既充当固相，又为微生物生长提供营养的初级农作物产物，如麸皮、马铃薯、谷子、豆饼以及其他含淀粉和纤维素的农作物产品。第二种固态发酵采用的固体是惰性载体，这些载体可以是天然的，也可以是人工分成的。这些载体材料有大麻、珍珠岩、聚氨酯泡沫体、蔗糖渣和聚苯乙烯等。固体底物基质固态发酵的一个主要的不足之处就是碳源是它们的结构组成部分，在微生物发酵生长过程中，培养基被分解了，底物容易结块，孔隙率也降低，结果底物的外形和物理特性都发生了变化，降低了发酵过程中的传质和传热。例如，麦片在发酵过程中由于淀粉的降解和水的挥发，会导致固体底物变形结块，结果使传质和传热受到影响。而具有稳定结构的固态载体充当固态发酵的固相可以克服这一缺点，从而更有利于微生物的生长和产物产量的增加。例如，采用聚氨酯泡沫体为载体吸附固态发酵核酸酶P1时，产量和活力分别比采用麸皮固态发酵提高9倍和4倍。另外，惰性载体吸附固态发酵与固体底物基质固态发酵相比，还具有产物提取简便的优点。可以很容易地从惰性载体中提取到胞外产物，而且所得到的产物含有较少的杂质，载体还可以重复使用。例如，利用聚苯乙烯作为载体，以肋生弧茵产生L-谷氨酰胺酶时，产物比采用麦麸粉固态发酵时得到的产物黏性要低。另外，前者的产物不含蛋白质污染物，而后者含有多余的淀粉酶和纤维素酶等。与固体底物基质固态发酵相比，惰性载体吸附固态发酵还具有其他很多优点，如：能够对培养基营养成分进行合适的调节；容易了解产物中的各成分并进行分析，从而有利于发酵过程的控制以及动力学研究与模型建立等。第三节固态发酵反应器生物反应器提供生物生长的环境，可以阻止外物进人和内部物质的外溢，必须无毒、耐振动、不易腐蚀，有良好的搅拌、通气、散热、冷却系统，能够进行无菌操作。固态发酵不同于深层液态发酵，反应基质以固态形式存在，反应体系内的传递过程极其复杂，包括气—固、气—液、液—固等形式，气相是其最主要的流动介质，因此固态发酵生物反应器与液体发酵反应器有着显著的区别，而目的限制固态发酵反应用于现代生物反应工程的一个重要因素就是适用的固态发酵反应器。迄今为止已有许多类型的固态发酵反应器问世(包括实验室、中试、工业生产规模)。B.Lonsane曾经归纳出了九种不同形式的工业规模的固态发酵反应器；转鼓式，木盒式；加盖盘式；垂直培养盒式，倾斜接种盒式，浅盘式，传送带式；圆柱式；混合式等。K.E.Aidou也提出了十种不同形式的固态发酵反应器，但以基质的运动情况则可以分为两类：①静态固态发酵反应器，包括浅盘式和塔柱式反应器；②动态固态发酵反应器，包括机械搅拌的筒柱式、转鼓式反应器等。第一类反应器内发酵基质在发酵过程中基本处于静止状态。其优点是结构简单，操作方便，放大问题小；其明显的缺点是：由于发酵基质的相对静止，热量、氧气和其他营养物质的传递困难，从而导致基质内部温度、湿度、酸碱度和菌体生长状态的严重不均匀。第二类反应器中的基质处于间断或连续的运动状态．而强化了传热和传质，设备结构紧凑，自动化程度相对较高，但由于机械部件多，结构复杂，灭菌消毒比较围难，固态基质的搅拌能耗过大，发酵物料的持续运动有可能会破坏菌丝体，从而影响菌体的生长与代谢。对于实验室规模的发酵过程，搅拌所起的作用(如促进物质传递，使发酵基质内部参数均匀)不一定十分显著，因而这种设备的放大是一个突出的问题。无论何种形式的固态发酵反应器，都必须考虑以下几个方面的问题：①接种技术；②灭菌方式；③发酵基质的特性；④供气手段；⑤参数的测量和控制；⑥取样分析技术；⑦结构简单，操作方便。固态发酵由于其基质以固态存在，所以不能像液体发酵那样可以用摇瓶进行大量的基础研究，而只能依靠设计合理、控制手段完备的固态发酵反应器。固态发酵反应器主要由两部分组成，即反应器主体和供气、控温、保温系统，后者的主要目的是保持发酵系统的需氧状态和调节发酵基质的温度和湿度。一、静态固态发酵反应器与动态固态发酵反应器1，静态固态发酵反应器目前静态固态发酵反应器(见表1.3)在实验室研究中应用较为普遍，尤其是圆柱式的固态发酵反应器。文献报道的系统多是将一个或多个静态圆柱式反应器平行放在一个恒温箱中并通以饱和空气。其优点是：①系统简单，廉价，操作方便；⑦克服固态发酵无法用摇瓶法作大量基础研究的缺点，同时可作多条件的平行实验并且温度、湿度等条件均一；③系统易灭菌。其缺点是：①无法准确控制气体和物料的湿度，只能供饱和湿空气；①无法取样分析；③放大过程中难以消除床径扩大的影响。静态固态发酵反应器无论体积、高径比如何变化，其基本形式是不变的．但供气、保温、控温系统却是千差万别的。完善的固态发酵供气、保温、控温系统应有以下持点：①测量并控制进气组成、湿度及温度；⑦测量尾气组成并反馈调节进气组成、湿度和温度；③在较大规模应用时采用循环供气；④完善的气体过滤设备。具体应用时，应根据研究目的加以简化，以求经济节约。表1.3静态固态发酵反应器2，动态固态发酵反应器(1)转鼓式其基本形