两株乙酰甲胺磷降解菌的分离鉴定及降解特性研究

基金项目：国家863高技术研究发展计划(2007AA10Z404)收稿日期：2009-9-作者简介：于彩虹（1973~），女，副教授,主要从事环境微生物、生物化工方面的研究工作。Email:[e-mail]两株乙酰甲胺磷降解菌的分离鉴定及降解特性研究于彩虹1张显涛1宋英男1张帅1路兴波2孙红炜2*（1.中国矿业大学（北京）化学与环境工程学院，北京100083；2.山东省农业科学院植物保护研究所，山东济南250100）摘要：利用富集及驯化培养方法，从长期生产农药的企业废水处理系统及厂房周边的污染土壤和池水中，分离筛选出两株能够高效降解乙酰甲胺磷的菌株Y3、Y6。在形态特征和生理生化鉴定的基础上，对其16SrDNA序列进行了分析，并重点研究了它们对乙酰甲胺磷及其它农药的降解特性和抗性。结果表明，Y3、Y6分别为寡养单胞菌（Stenotrophomonas）和假单胞菌（Pseudomonas）。Y3、Y6在乙酰甲胺磷浓度分别为500mg·L-1和1000mg·L-1，培养温度30℃，初始pH8.0，接种量为2.5%条件下，一周内可以将80%左右的乙酰甲胺磷矿化为磷酸根。外加葡萄糖及酵母膏对降解效率的研究表明，当酵母膏含量为1g·L-1时，降解效果最理想；而外加葡萄糖的量，会相对抑制农药的降解。抗性实验显示，Y3、Y6均可在较高浓度的其它有机磷类及氨基甲酸酯类农药的普通培养基中生长，对其它农药的抗性也比较广泛。植物侵染实验显示，Y3、Y6对试验中的豆科、禾本科、十字花科及葫芦科植物不具备致病性，说明Y3、Y6环境安全性较强。关键词：乙酰甲胺磷；菌株；降解特性Isolation,identificationanddegradationcharacteristicsoftwoacephate-degradingbacteriaYuCaihongZhangXiantao1SongYingnan1LuXingbo2SunHongwei2*(1.SchoolofChemicalandEnvironmentalEngineering,ChinaUniversityofMiningandTechnology(Beijing),Beijing100083;2.InstituteofPlantProtection,ShandongAcademyofAgriculturalSciences,Jinan250100)Abstract:Inthisstudy,bythemethodofenrichmentanddomestication,weisolatedtwostrainsofbacteria2designatedasY-3andY-6,respectively,fromthewastewatertreatmentsystemofthepesticideenterpriseaswellasthesoilandwaterarounditsworkplace.Thetraditionalmorphology,physio-biochemicalcharacteristicsand16SrDNAgenesequenceanalysiswereappliedtothebacteriaclassification.Thecharacteristicsofdegradingacephateandtheresistanceofanyotherpesticideswerealsostudied.TheresultsshowedthatstrainsY-3andY-6wereidentifiedasStenotrophomonasspandPseudomonassp.Withtheinitialacephateconcentration500and1000mg·L-1,theinitialpHvalue8.0,30℃,theratioofbacteriasuspension(OD600=2)2.5%,thecompletelydegradationrateswerebothabout80%.Thestudyalsodemonstratedthattheoptimumcontentoftheyeastextractwas1g·L-1,whilethecontentoftheglucoseinhibitsthedegradationofacephate.Theresistanceexperimentsshowedthat,Y-3andY-6couldalsobefoundinhigherconcentrationsofothertypesoforganicphosphorusandcarbamatepesticidesinthegeneralgrowthmedium,whichhavemoreextensivepesticideresistance.Plantinfectionexperimentsshowedthat,Y-3andY-6almostdonothaveanypathogenicityontheLeguminosae,Gramineae,CruciferaeandCucurbitaceaeplants,safetotheenvironment.KeyWords:acephate;strain;degradationcharacteristics乙酰甲胺磷(Acephate)又名高灭磷，化学名称为O,S-二甲基乙酰基硫代磷酰胺酯，是杀虫剂甲胺磷的N-乙酰基衍生物，分子量183.16，结构式为：乙酰甲胺磷是一种高效、低毒、低残留、持效期长、内吸性强的广谱性有机磷杀虫剂。从2007年1月1日起，中国已全面禁止在农业生产中使用甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷、久效磷、磷胺等5种高毒农药，乙酰甲胺磷作为替代高毒农药的一种主打产品而广泛应用于我国蔬菜、果树和水稻等作物的害虫防治[1]。2007年乙酰甲胺磷在中国的产量仅有4000吨，近年来起产量逐年剧增，有望成为万吨农药品种[2]。虽然，人们一直认为乙酰甲胺磷是一种低毒农药，对环境安全性高，被广泛用于粮食、蔬菜和水果生产中，但近年来在中国很多地区的蔬菜、茶叶及海鲜产品的农药残留检测中都发现乙酰甲胺磷的残留超标问题[3,4,5,6,7]，研究表明乙酰甲胺磷在菠菜中代谢较慢，30%的乙酰甲胺磷采用1100ml/hm2的施药量在15天后，仍能够检测到乙酰甲胺磷的残留[8]。乙酰甲胺磷易溶于水，在土壤中易淋溶，易对水体造成污染，在莱州湾海域部分地区能检测到的乙酰甲胺磷含量较高[9]。而且乙酰甲胺磷在植物和动物体内很容易被代谢成毒性更高的甲胺磷。最新3的水生物毒理学研究表明，亚致死浓度的乙酰甲胺磷对萼花臂尾轮虫实验种群动态具有显著的影响。随着乙酰甲胺磷在中国的大量生产和使用，相关农药废水的处理、食品和环境中乙酰甲胺磷的残留等问题会越来越突出，并且农药给环境带来的副作用在使用后很长时间才能显现出来。因此，如何降低乙酰甲胺磷的污染和残留问题变得日益重要。土壤中的有机污染物主要是依靠微生物降解，所以利用生态系统中微生物代谢类型的多样性、生化适应能力的极强性以及能迅速产生相应酶系的应急性，来快速降解各类人工合成的农药，使其完全矿化成无机物，是目前最有潜力最有效的研究方法之一[10,11]。而迄今为止，人们对于乙酰甲胺磷的微生物降解菌的研究较少。因此，分离筛选具有高效降解乙酰甲胺磷农药的微生物，对消除农药污染、净化环境及社会的可持续发展具有重要的现实意义。所以本研究的目的是从农药污水处理池中采样，通过富集和驯化培养，获得以乙酰甲胺磷为唯一碳源的高效代谢菌株，对其进行菌种鉴定，并测定降解特性及致病性。1材料与方法1.1试验材料1.1.1培养基（均加1L蒸馏水，农药适量添加）液体富集培养基：牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g液体驯化培养基：NaNO31.0g,NaCl0.5g,K2HPO41.5g,KH2PO40.5g,(NH4)2SO40.5g,MgSO40.5g,酵母膏0.5g（可加入15g琼脂制成驯化平板划线分离）降解测定培养基：KNO31.0g，(NH4)2SO40.5g，KCl0.5g，酵母粉0.05g1.1.2药品与试剂92%的乙酰甲胺磷原药（取自山东华阳农药集团），其它试剂均为分析纯（购自北京中北林格生物科技有限公司）。1.1.3样品采集采自山东华阳农药集团厂房周边，以及厂区污水处理系统曝气池曝气泵周围的土样、水样，该厂长期生产有机磷杀虫剂及其它各类农药。1.2菌种的富集与驯化对取到的样品先进行富集培养，起初选择药液的浓度为50mg/L，以周为单位更换培养基并逐步提高农药选择液的浓度（具体时间以富集效果而定，有时适当延长富集培养的时间）。当富集培养液中的选择液浓度至少达到500mg/L后，转入驯化培养基培养。配备相应的固体培养基平板，驯化过程涂布观察以及划线分离。将得到的菌株在一般环境下，粗测降解效率较高的两株菌命名为Y3、Y6，作为重点研究对象，并用甘油液封，-20℃保藏。常用待测的菌种置于乙酰甲胺磷为5000mg/L的斜面培养基5℃保藏。1.3两株降解细菌的鉴定1.3.1生理生化特性测定按照《微生物学实验》[12]，对筛选到的2株细菌进行革兰氏染色、过氧化氢酶、淀粉水解、尿素反应、硝酸盐还原与糖醇利用等生理生化特性以及4温度、pH值适应范围及耐盐性的测定。1.3.216SrDNA扩增、序列测定及同源性比较菌株基因组的鉴定采用16SrDNA序列分析的方法。使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取Y3,Y6的基因组DNA，以此为模版PCR大量扩增各菌的16SrDNA序列。PCR扩增正向引物为F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反向引物为R：5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火50s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃延伸8min。然后用1%琼脂糖电泳检测PCR产物。得到的16SrDNA序列扩增产物用DNA回收纯化试剂盒纯化后由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测得的序列登陆NCBI网站，通过Blast程序与Genbank中核酸数据进行比对分析构建系统发育树。1.4乙酰甲胺磷降解量的检测使用钼蓝比色法[13]，直接测定反应后培养液中磷酸根离子的质量，从而间接确定细菌直接矿化乙酰的量。菌种在降解测定培养基内培养一段时间，取1mL反应后培养液定量稀释加入50mL的容量瓶内，然后加入5ml钼酸铵溶液和3ml抗坏血酸溶液，用水稀释至刻度,摇匀。于室温下放置10min后测定其OD720的值，对照标准工作曲线，求出50mL容量瓶内PO43-的浓度WP，进而求出1mL待测液中彻底降解的乙酰甲胺磷的量，公式如下：降解的乙酰的量m=(Wp×MY)/20×Mp其中Mp—PO43-的分子量，值为95；MY—乙酰甲胺磷的分子量，值为183。降解率w=(1000×m/m0)×100%m0—初始加入的乙酰甲胺磷浓度。1.5菌母液的制备将各菌接入液体普通培养基过夜培养，待培养基完全浑浊后以蒸馏水为空白测定吸光度，加适量生理盐水将菌液调至OD600=2.0备用。1.6环境条件对菌株降解乙酰甲胺磷的影响1.6.1农药浓度对降解率的影响粗测得Y3、Y6降解效率相对较强，单独进行测定。农药浓度设100，200，500，1000，2000mg/L5个梯度，初始pH为7.0，2.5%的接种量接菌，于30℃，150r/min的摇床内振荡培养。一周后测定乙酰甲胺磷降解量和降解效率。（用1.4节的方法）1.6.2初始pH对降解率的影响选择Y3、Y6最适宜的农药浓度，初始pH设5.0，6.0，7.0，8.0，9.05个梯度，其它条件同1.6.1。一周后测定乙酰甲胺磷降解量和降解效率。1.6.3接种量对降解率的影响选择Y3、Y6最适宜的农药浓度和初始pH，接种量设0%，1%，2.5%，5%（体积比，所配菌悬母液OD600=2.0）4个梯度