抗癌新药火菇素的提取及科研历程

1抗癌新药火菇素的提取及科研历程张长铠、张文阁、张冰华摘要抗癌新药火菇素，是目前发现的少有的无毒副作用的抗癌活性物质，是人类以前从未发现的全新蛋白。火菇素具有明显的抑癌活性，小分子片段对癌细胞具有强大的靶向攻击效用。而火菇素对生物免疫功能的增强及对生命延长的特异效果，更给人类医疗保健事业，开拓出了极为广阔的前景。火菇素是从金针菇中提取的，李时珍在《本草纲目》中，对其抗癌活性已有认识。火菇素的科研道路曲折漫长，了解其历程，可对以后的科研提供经验和教训，以加快中医药现代化的历史进程。关键词抗癌新药火菇素科研历程火菇素（flammulin）项目是中医药现代化研究的典型项目之一，填补了多项空白。但其历时漫长，道路崎岖，教训颇多。了解火菇素的科研历程，可使新项目少走弯路，直奔主题，可有效加快中医药现代化研究的科研进程。“抗癌新药—火菇素的提取”，是山东大学和青州市食用菌研究所，共同承担的山东省“八五”、“九五”重点攻关项目，国家“十一五”科技攻关重点项目，经过几十年的努力，已经完成了提取工艺的完善及临床前的相关研究。这是抗癌活性物质研究2方面的一个重大突破，为世界上首次获得火菇素晶体，各项研究居世界领先水平，属一类新药，具有广阔的应用前景。火菇素是一种简单的单亚基碱性蛋白质，不含糖，为雪花状晶体，经工艺改进后，对分子量进行了精确测定，电泳纯为19891.13道尔顿，通过国际上权威的NCBI提供的蛋白质数据库检索表明，火菇素为以前人类未发现的全新蛋白。火菇素的理化性状稳定，pH4.6-9.4范围内结构基本不发生变化，半衰期为256天，可长期保存，为针剂应用提供了科学依据。火菇素具有明显的抑瘤活性，经中国肿瘤免疫和生物治疗专业委员会副主任、中国肿瘤生物治疗杂志社副主编崔正言研究员指导下，山东省医学科学院对火菇素进行了有关病理、毒理、药效学等方面的实验。实验表明：火菇素对小鼠S180、艾氏腹水瘤，注射15天后，皆有明显的抑瘤效果，瘤体缩小一半以上，生命延长率可达104.72％，经注射30天后，部分成为结缔组织。对人急性早幼粒细胞（HL-60）、人肝癌细胞（H-7402）的抑制率也非常明显，优于已知的药物。火菇素的LD50为98.36㎎/㎏，为治疗最佳剂量的50-100倍，实验过程中未发现有毒副作用，各组实验动物体重皆有不同程度的增加，被试动物解剖未见脏器的病理变化。在大量的实验中，又发现了火菇素的另一个特性，将火菇素的分子结构剪切成1000-10000道尔顿的小分子片段，更增强了对癌细胞攻击的靶向效应，疗效倍增。从这一角度出发，3向国务院国家自然科学基金申报了“火菇素抗肿瘤靶位点的确定及其分子改造的研究”课题（批准号：3037014,2004.1-2006.12），2007年通过国家验收。火菇素是从金针菇中提取的。金针菇，我国古代称蘑菇蕈、朴菇、构菌、金钱菌等。唐代韩谔的《四时纂要》中已有记载，李时珍在《本草纲目》中指出其可“益肠胃，化痰、理气”，对其抗癌活性已有所认识。日本长野县有食用金针菇的习惯，该地区癌症的发病率甚低。这一状况，引起了各国科学家们的注目和研究，公认在金针菇中有一较强的抗癌活性物质，这就是所说的火菇素。日、韩、美、英、新加坡的科学家对其做了大量研究，但因长期以来对其理化性状缺乏足够的了解，其提取工艺步入了常规的误区，故均未获得成功。目前，世界上的抗癌药物皆毒副作用大，多数患者不是死于癌症本身，而是死于治癌药物对机体的戕害。火菇素是迄今世界上已知的毒副作用最小的抗癌活性物质。专家们认为：火菇素提取工艺的研制成功，给人类征服癌症带来了希望的曙光；而火菇素对生物免疫功能的增强及对生命延长的特异效果，更给人类医疗保健事业，开拓出了极为广阔的前景。该工艺是一系统的综合利用工程，在提取1克火菇素的同时，还可提取金针菇多糖16.2克，毒性蛋白20毫克，氨基酸营养液10公升。金针菇多糖是优良的免疫调节剂，与香菇多糖功能相近。不4为α-淀粉酶所分解，而是在肠膜上以整个大分子形式被肠壁吸收。除对人体直接提供能量外，还可以诱发干扰素生产，对体液调节和增强免疫功能皆十分明显。而香菇多糖目前进口到岸价为220元/支（1毫克），临床应用则为300-400元/支（1毫克）。如该项目投产，价格可降低到香菇多糖的十分之一，让广大患者用上价廉物美的国产新药。毒性蛋白是一种新一代降压药，副作用小，用量少，疗效好。金针菇氨基酸营养液，其氨基酸含量搭配较合理，氨基酸的含量高达8261㎎/100ml，是老人、小孩。病弱者优良的营养补充剂。提取后的金针菇残渣，蛋白质含量16％左右，加工后可为优良的饲料添加剂。本项目是一个综合性高科技大型生物系统工程，由于其疗效好、毒性低、分子结构明白，是少有的具有我国自主知识产权、各项条件符合进入国际市场，成为全球性药物的新药。目前，世界上创制一个一类新药，2010年需耗资12-15亿美元，12-15年的时间，而该项目包含了3个一类新药，1一个保健类药，其科学价值是难以估量的。该项目每年可大量、高效、循环利用农作物秸秆4万吨。采完金针菇后，培养料中含有5-6％的菌体蛋白，可重复利用作草菇的培养基，还可进行沼气生产，获取清洁能源，满足部分生产需要及金针菇原料种植基地的大棚供暖使用，残渣可作为有机肥料，对恢复土壤的团粒结构大有助益。废水不含有5害物质，可循环利用或直接用于农田灌溉。所以该项目对合理利用农业资源，建立农业生态的良性循环系统，具重大意义。本项目已列入山东省高新科技产业化重点项目（鲁政发［1997］119号），并列入火炬计划项目，新药基金资助项目，山东省自然科学基金资助项目，国家自然科学基金重点项目。省委、省政府、省教委、省卫生厅、省科技厅、省食品药品监督管理局、潍坊市、青州市各级领导皆表示了关注和支持。在项目进行期间，国家科技部、国家教委、山东省科技厅、山东省财政厅、国务院等资助该项目200余万元。2005年11月25日，针对该项目产业化生产的可行性所涉及的金针菇菌种的培育、金针菇原料基地的建设、金针菇所含有效物质的提取及火菇素的医疗价值、环境保护、良性循环生态系统的建立等问题，通过了国家发展和改革委员会投资研究所与国家发展和改革委员会宏观经济研究院等有关单位专家的论证答辩。世界上围绕着火菇素课题共发表有影响的科技论文28篇，有26篇为本课题组所撰，仅在2002年进入国际学术榜（SIS）的就有两篇。自1984年，我们即关注金针菇含有较强的抗癌活性物质的报道。但当时金针菇栽培技术原始，仅福建漳州有少量瓶栽，不能适用于药物提取的大量需要。青州市食用菌研究所，从巴斯德消毒原理到亚高温消毒，历6经探索、实验，终于研制成功了“金针菇简易大规模优化生产技术”，并迅速推广，1988年通过技术鉴定，1989年7月，其论文获山东省第二届科技论文二等奖。随之该技术信息在多家报刊登载，在全国迅速普及，使全国年产金针菇不足百吨，迅速增至20万吨，使我国成为金针菇生产第一大国，终于将这一供奉君王的宫廷佳肴端上了普通百姓的餐桌。1990年，得到了国家的高度评价和奖励。解决了原料供应的技术问题，历尽艰难曲折，终于在1994年获得了火菇素晶体，进行了初步的药理、毒理实验，效果令人欣喜过望，明显优于已知的抗癌药物，且无毒副作用。遂在1995年3月，申报了国家专利。同年4月，以世界领先水平成果通过了技术鉴定。为了适应于工业化生产，又用了多年的时间，对火菇素的提取工艺不断改进和进行生物活性测定，火菇素的分离纯化及分子量的测定，晶体初测分子量为23700-23800道尔顿；达到电泳纯后，分子量为19891.13道尔顿。又相继完成了火菇素的定量技术，火菇素的质谱研究，火菇素的定性技术，火菇素的圆二色性与溶液二级结构的研究，以及火菇素纯化流程的改进等尖端课题。但在动物实验中，渐次发现受体的抗药性随着时间的延长而日趋明显。对新药来说这是一个致命的缺陷，甚至因此而前功尽弃。课题组又多方探索，条分缕析，历经数年，对火菇素分子中的酪氨酸残基和其他疏水氨基酸残基形成的疏水微区进行了改7造，结果消除了火菇素的抗原生成，且增加了抗肿瘤活性。2002年12月，山东省科技厅在听取了火菇素课题组汇报，并作了答辩后，出具了火菇素课题已完成了临床前研究的文件，肯定了课题组取得的阶段性成果，圆满的完成了国家交给的多项课题研究任务。而课题组当时有一重大发现，即火菇素1000道尔顿左右的分子段片，对肿瘤细胞有明显的靶向攻击作用。遂停止一切收尾工作，全力以赴围绕火菇素的小分子段片的制取工艺及靶向作用机理进行探讨。一面又向国务院国家自然科学基金申报“火菇素抗肿瘤靶位点的确定及其分子改造的研究”。很快获得了批准，2007年圆满完成了课题，通过了国家验收。青州市食用菌研究所也围绕着高含火菇素菌种的驯化、培育、提高细胞壁渗透压并保持遗传性能稳定及相应的栽培技术进行了长达十年的探索，终于圆满的完成了这一课题，每公斤干品稳定在提取火菇素55-60毫克，多糖含量也比常规及国外品种高出1-2倍，而来自美、日、韩、英等国的金针菇菌种，每公斤干品仅能提取12-18毫克，且成本高昂，毫无商业价值。青州市食用菌研究所培育的青州金针菇九号，遥居世界领先水平。此外，美国北卡罗莱纳大学完成了火菇素超微结构的相关研究，北京大学生命科学学院完成了替代中试，验证火菇素提取工艺科学与否的工艺还原试验，结果证明了工艺的科学性。山东省医学科学院、山东省中医药研究院、山东省防疫站，杏林春膏贴8科学院研究所皆圆满的完成了有关课题及任务。这是一个巨大的生物科技系统工程，涉及学科多、单位多、水平高，需要多方协调各扬优势，充分利用科研资源，因为任何单位在尖端科技面前不能处处领先。课题组在极其艰难困苦的情况下，以“筚路蓝缕，以启山林”的大无畏奉献精神，劈开层峦叠嶂，踏平荒原林莽，终于为人类征服癌症的事业开出了一条通途。二十余年来，所得的最大经验和教训有以下几点：一、必须重视科研队伍的建设。课题组长张文阁在1996年发表的一篇总结性文章中指出：科学工作者“要以国家民族利益为重”，“不能斤斤计较于本单位和个人的得失。要义无反顾，披荆斩棘，踏平一切艰难崎岖”；科研团队“必须团结一心，万难不改，持之以恒的去争取胜利完成所肩负的科研任务”。课题组领导核心皆以身作则，率先垂范。课题组副组长，首席科学家张长铠教授，毕生的科研黄金时期，皆倾注在火菇素这一个课题上。身为博士生导师、山东大学生命科学学院院长、山东省高新技术产业化协会会长、山东微生物学会理事长、教育部高等教育指导委员会委员、山东省高等教育指导委员会副主任、国家科技奖评奖专家等一系列耀眼光环，由于火菇素尚未产业化，又无其他收入，而致其小女儿至今无房。因为火菇素的一些核心技术属于国家机密，不能写成论文，也就丧失了申报两院院士的时机。周凯松博士是火菇素课题组最得力的人员之一，虽然在瑞典皇家科学9院表现优异，但抱着一颗报效祖国的丹心回国后，因课题尚未产业化，只好到其他厂家打工，等待时机。张长铠院长退居二线后，凌建亚教授负责该课题，由于国家对新药研究有新的要求，若干实验需要新做，直到40岁，拖到不能再拖了，爱人才生第一个孩子。由于国家政策变动，党政军有关单位相继撤出杏林春生物科技开发有限公司（当时是国内外唯一一家由党政军民联合创办的公司），公司遭到了重创，青州市食用菌研究所也深受其累。在多年未发工资的情况下，所长张冰华，靠创收完成了高含火菇素青州金针菇9号菌种的一系列科研工作，取得了世界领先水平的重大成果。为了保证课题实验材料的供应，率领职工，克服一切困难，甚至为人打工，挣经费保证实验材料的生产。不论风刀霜剑，不论日晦月明，历尽沧桑20余年，源源不断的保证了实验材料的供应。2007年，有一港商受外商之托，经一部门领导来购买青州金针菇9号及其相关技术，从2000万美元递升到5000万美元，青州市食用菌研究所不为所动，因为他们深知这涉及国家利益，宁愿艰难度日，也绝不为了金钱而出卖国家民族，表现出了中国科技工作者的高风亮节和高贵情操。课题组组长张文阁，二十余年来，遭受了家庭的重大变故，为了课题进展及产业化，