DB13T 2892-2018 禽白色念珠菌病综合诊断技术规程

ICS11.220B43DB13河北省地方标准DB13/T2892—2018禽白色念珠菌病综合诊断技术规程2018-12-13发布2018-12-31实施河北省市场监督管理局发布DB13/T2892—2018I前言本标准按照GB/T1.1－2009给出的规则起草。本标准由河北工程大学提出。本标准起草单位：河北工程大学。本标准主要起草人：刘建钗、柳焕章、赵振宇、刘娜、张鹤平、姬国强、李聚芹、乔铁库、刘彦威、刘艳莉、张良、董改琳、薛素琴、孙冰玉。DB13/T2892—20181禽白色念珠菌病综合诊断技术规程1范围本标准规定了禽白色念珠菌病综合诊断技术的临床诊断、实验室诊断和综合判定。本标准适用于鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌鹑等禽类白色念珠菌病的诊断及其白色念珠菌病原的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489-2008实验室生物安全通用要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。GMA-Grocott：六胺银染色PCR：聚合酶链式反应PDA：马铃薯葡萄糖琼脂培养基PAS：过碘酸雪夫氏染色SYBRGreenⅠ：DNA荧光染料TTC：红四氮唑显色培养基TSA：胰蛋白胨大豆琼脂培养基YEPD：酵母浸出粉胨葡萄糖培养基4临床诊断当禽出现以下部分或全部情形时，可作为初步诊断的依据。4.1临床症状各日龄禽均可感染，雏禽易感。病禽嗉囊肿胀，触感松软，内容物或口水气味酸臭；在喙、口腔、舌有溃疡灶或伪膜；粪便常伴有未充分消化的饲料；个别病禽有皮肤结痂或脱毛、眼部感染等症状。4.2剖检病变在口腔、咽喉、食道、嗦囊和腺胃等消化道黏膜上有乳白色斑片、溃疡或鳞屑状病变；严重者嗉囊阻塞充血、腺胃壁增厚、肌胃内膜糜烂，肝脏淤血或有出血斑、坏死灶，脾、肾肿大明显，表面白色坏死灶。5实验室诊断包括常规检测和定量PCR检测技术。参照GB19489-2008的相关条款。DB13/T2892—201825.1常规检测5.1.1样品的采集取病禽嗉囊、肝脏、肾等病料，放入无菌的平皿中，剪开嗉囊，用拭子擦拭嗉囊内表面，放入1.5mL灭菌EP管中备用；其他器官用无菌剪刀各取小块组织两份，用灭菌水充分冲洗后，一份接种于YEPD平板上（1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%琼脂粉），一份放入40g/L甲醛固定液中待用。5.1.2病原菌的分离纯化与形态观察将接种病料的平板放入培养箱，28℃恒温培养，每天观察菌落生长情况；3d后用接种环挑取平板上的疑似菌落，划线接种于YEPD平板培养基继续分离培养，3d后将疑似单菌落进行涂片、染色和镜检，取酵母状细胞的对应菌落菌体进一步接种于PDA试管斜面，28℃培养3d后保存备用。对照白色念珠菌典型菌落形态和菌体形态特征进行初步鉴别,参见附录A,。5.1.3显色培养鉴别用接种环挑取疑似菌株的菌体，分别划线接种或稀释后涂布于TTC和CHROMagarCandida显色培养基平板的划定区域，如两者均呈现白色念珠菌特征性色泽即可初步诊断为阳性,参见附录A。5.1.4组织切片检查将40g/L甲醛固定液中样本固定24h后取出，经修块、脱水、透明、浸蜡包埋、切片、HE染色、PAS和GMA染色，显微镜观察组织病理和病原生长情况,参见附录A。以病料中检查到菌丝或孢子为阳性结果，病料中连续两次检查不到菌丝和孢子为阴性。5.2定量PCR检测5.2.1样品采集选择有典型症状的病禽，无菌采血或病变组织（肝、脾），放入1.5mL灭菌EP管中，将EP管编号，记录样本信息，-20℃保存备用。5.2.2基因组DNA提取取组织样本0.2g放在研钵中，加入适量液氮，待液氮即将挥发殆尽时迅速研磨成粉末状，收集样本0.05g～0.1g于1.5mLEP管中，加入500μL裂解液（400mMTris-HCl[pH8.0]，60mMEDTA[pH8.0]，150mMNaCl，1%sodiumdodecylsulfate），室温放置10min；加150μL乙酸钾(pH4.8)，漩涡震荡，离心12000g，1min，取上清液放入新试管，加入等体积异丙醇；DNA团块用70%乙醇清洗，干燥后，溶解在50μLTE（10mMTris，1mMEDTA）中保存。5.2.3引物合成参照GenBank已发表的白念珠菌rDNA基因内转录间区序列，采用PrimerExpress6.0软件设计一对特异引物（预期扩增片段大小273bp）：上游引物F：5′-TTTATCAACTTGTCACACCAGA-3′下游引物R：5′-ATCCCGCCTTACCACTACCG-3′5.2.4定量PCR反应体系和反应程序采用25μL的反应体系：SYBRPremixExTaq（2×）12.5μL，上、下游引物各0.5μL，DNA模DB13/T2892—20183板1.0μL，用双蒸水补足至25μL。反应程序为：94℃预变性3min；94℃10s，60℃30s，72℃30s，进行35个循环。5.2.5标准曲线和熔解曲线从白色念珠菌106～100copies/μL一系列模板特异性克隆的SYBRGreenⅠqPCR反应荧光曲线可见，在106～101copies/μL浓度范围内荧光曲线呈“S”形。以线性范围内6个浓度（106～101copies/μL）的特异性克隆为模板在同样条件下进行SYBRGreenqPCR反应，得到标准曲线和熔解曲线。5.2.6结果判断当待测样品实时荧光定量PCR检测结果有“S”型扩增曲线，Ct值≤36.5，且Tm值为85℃时，判定待测样品中含有白色念珠菌，而且可通过Ct值大小判断感染的程度可参见附录A。未出现“S”型扩增曲线和Tm值，则判断样品中不含白色念珠菌。6综合判定结合临床诊断、实验室检测结果，可确诊禽白色念珠菌病。DB13/T2892—20184附录A(资料性附录)菌落形态和菌丝及孢子形态特征A.1镜检将每个取样EP管封盖，瞬时振荡，用无菌棉签沾取悬液于YEPD庆大霉素培养基平板涂划接种，于28℃恒温培养36h～48h；将疑似单菌落取菌体经革兰氏染色和棉蓝染色镜检，将革兰氏阳性反应且为酵母状细胞的相应菌落取菌体分别接种于沙保弱培养基平板、玉米粉吐温琼脂培养基平板、TSA血液培养基平板和无菌载片，于28℃恒温、保湿培养3d～4d，观察平板菌落特征并直接镜检载片培养物形态特征。A.2判断沙保弱培养基平板上可见灰白色、光滑的细小菌落，3d可见菌落增大、隆起，边缘齐整，乳白色润泽状，5d菌落密集部位长出菌丝；TSA血液培养基平板上菌落生长较快，4d可见菌落边缘与基质内部有大量丝状菌体出现；玉米粉吐温琼脂培养基平板上菌落生长较慢，6d可见菌落边缘与基质内部有大量丝状菌体出现。革兰氏染色和棉蓝染色见菌体大小不等，且可见分隔菌丝。直接镜检载片培养物可见菌丝（芽管）、厚垣孢子。将同时看到菌丝状菌落、菌丝（芽管）、厚垣孢子形态者记录为阳性结果。A.3TTC和CHROMagar显色培养用接种环挑取疑似菌株的菌体分别划线接种于两种显色培养基平板的划定区域，在同一平板的相邻区域分别接种已知白色念珠菌作对照；也可将疑似菌株用无菌水稀释，取适当稀释菌悬液涂布鉴别平板。接种后于37℃恒温培养2d～3d，观察显色结果。以出现乳白色至淡粉色（TTC）或翠绿色（CHROMagar）菌苔（菌落）者为阳性结果，其他颜色为阴性结果。A.4组织中白色念珠菌特异性染色阳性样本可见嗉囊的黏膜复层扁平上皮明显增厚，并发生角质化和上皮细胞脱落现象，大量菌丝穿过粘膜上皮；肝、脾中见菌丝或酵母状细胞。_________________________________