DB13T 5110-2019 植物组织培养室组建及操作技术规程

ICS65.020.40B61DB13河北省地方标准DB13/T5110—2019植物组织培养室组建及操作技术规程2019-11-28发布2019-12-28实施河北省市场监督管理局发布DB13/T5110—2019I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由河北农业大学提出。本标准起草单位：河北农业大学。本标准主要起草人：师校欣、杜国强、高仪、王莉、杨丽丽、王燕霞、刘婉君、李宝鑫。DB13/T5110—20191植物组织培养室组建及操作技术规程1范围本标准规定了植物组织培养室组建及操作技术的选址、设施设备与试剂，室内环境，培养基制备，基本操作，消毒灭菌与日常管理等要求。本标准适用于植物组织培养研究实验室及组培快繁育苗工厂组建及常规操作。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB28232臭氧发生器安全与卫生标准LY/T1882林木组织培养育苗技术规程NY/T2306花卉种苗组培快繁技术规程DB13/T2596苹果组培苗繁育技术规程3选址、设施设备与试剂3.1选址及组成植物组织培养室（或组培工厂）选址应环境清洁，远离微粒和烟雾等污染源，水电供应充足，交通运输便利。植物组织培养室（或组培工厂）应包括培养基制备室、洗涤室、灭菌室、接种室、培养室、储藏室、研究室以及温室或大棚等8部分。其空间大小和装备程度可根据培养目的、规模、工作人数、经费和资源状况确定。应配置合理，工作方便，使用安全，节省能源。各部分比例大小和设备规模可参考附录A。3.2设施设备3.2.1培养基制备室应有适宜的空间和配套的工作台，便于多人同时操作。配备冰箱、电子分析天平、电子秤、酸度计、磁力搅拌器、净水器或蒸馏水器、电磁炉、培养基灌装机等仪器设备；配置不锈钢锅、培养瓶（三角瓶、试管、罐头瓶、耐高温塑料组培专用瓶）、培养皿、透明及棕色试剂瓶、烧杯、容量瓶、量筒、移液管、移液管架、微量移液器、玻璃棒、记号笔、封口材料（棉塞、牛皮纸、组培专用透气封口膜或组培专用透气瓶盖）、棉线绳、pH试纸、周转筐、蒸馏水桶、小推车等用品和用具；配备器械柜、药品柜、危险品柜，分别存放接种工具和分类存放化学试剂。3.2.2洗涤室应地面和水槽处的墙面防水耐湿、平整光滑易清洁。配置大型水槽、工作台、超声波仪、烘箱、塑料盆、塑料周转筐、毛刷、洗衣粉和洗洁精等。3.2.3灭菌室DB13/T5110—20192应配备合理专用输电线路，施工规范；配置空调、换气扇等通风设备；高压蒸汽灭菌器、干热消毒柜或恒温干燥箱（烘箱）、周转筐及小推车等设备或工具。工作规模较小、空间紧张时，洗涤室可与灭菌室合并。3.2.4接种室接种室外侧设置缓冲间，或将一个房间隔断成两部分，外部小空间作缓冲间，内部大空间做接种室。外界与缓冲间的门、缓冲间与接种室的门应错开，建议采用滑动门。缓冲间配备紫外线杀菌灯、洗手池、鞋架、衣帽钩、工作服、工作帽、口罩等，用于无菌操作前洗手、更衣、换鞋。有条件的单位可在接种室门口设置风淋室。接种室要求门窗密封防尘性能好，地面和墙壁平整光滑，便于清洁和消毒。配套的电源插座布局合理。配置紫外线杀菌灯、臭氧发生器、超净工作台、空调、接种器具灭菌器、广口瓶（盛放70%乙醇，用于浸泡接种工具）、酒精灯、打火机、接种工具（枪状镊、手术刀、手术剪等）、小推车、解剖镜、纱布、手持喷雾器等。3.2.5培养室培养室门窗、地面和墙面的要求同3.2.4接种室，另外要求保温性能好。配备光照培养架、光照培养箱、暗培养橱、震荡培养器（摇床）、光照控制系统、空调、暖气、除湿机、空气消毒器、紫外线杀菌灯、臭氧发生器、温湿度记录仪等。光照培养架设5～6层，最低层距地面20cm，层间距30cm左右，架长依40W日光灯管的长度决定，一般130cm，架宽60cm左右，每层架面安装2～3支日光灯或组培专用LED特定光谱灯，用自动定时器控制光照周期。培养材料固体培养时摆放在培养架上，也可置于光照培养箱中方便设定不同的培养条件。需要黑暗培养的材料，放置在暗培养橱中培养。培养材料液体培养时，用震荡培养器。3.2.6储藏室应干燥、通风、防火。配置橱柜、储物架，便于物品存放整齐有序。3.2.7观察室配置计算机及软件、图像拍摄设备等。3.2.8驯化移栽场地选用有防虫网或防虫设施的温室或大棚，用于组培材料的瓶外扦插生根和已生根试管苗的驯化移栽。棚室配置苗床、弥雾增湿装置、遮阳网、塑料薄膜、小拱棚架；营养钵或穴盘等移栽容器；营养土、草炭、蛭石等移栽基质；多菌灵等杀菌药剂。3.3试剂3.3.1消毒灭菌剂乙醇、次氯酸钠、84消毒液、氯化汞、新洁尔灭、抗生素、甲醛、高锰酸钾等。3.3.2无机盐和有机营养成分不同植物种类组织培养时适宜的基本培养基种类及配方不同，常用的基本培养基配方中无机盐和有机营养成分见附录B。糖类多用蔗糖，为降低成本可用食用白砂糖代替。其它还有葡萄糖、果糖、麦芽糖、山梨醇、半乳糖、乳糖、甘露糖等。DB13/T5110—201933.3.3植物生长调节物质细胞分裂素：6-苄基腺嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、玉米素（ZT）、2-异戊烯腺嘌呤（2ip）、苯基噻二唑基脲（TDZ）等。生长素：吲哚丁酸（IBA）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）等。赤霉素：GA3等。生长延缓剂：矮壮素（CCC）、丁酰肼（B9）、多效唑（PP333）等。3.3.4固化剂常用琼脂，其它还可用琼脂糖、卡拉胶、吉兰糖胶等。3.3.5培养基附加成分根据培养目的选择使用，常用的培养基附加成分有活性炭、水解乳蛋白（LH）、水解酪蛋白（CH）等。4室内环境4.1温度培养室温度应根据培养材料种类和培养目的，设定并调节在最适温度范围。一般情况下，25℃±2℃可满足多种植物组织培养对温度的要求。4.2光照4.2.1光照强度一般培养室光照强度控制在1000Lx～5000Lx，可根据不同培养物及不同培养阶段的需光特性调整光照强度；工厂化生产时，为降低成本可考虑利用自然光照。4.2.2光质培养室通常装配日光色荧光灯，也可装配组培专用LED灯，降低能耗，可根据培养植物的需求选用适宜的单色光质或复合光质。4.2.3光照周期根据培养材料对光周期的要求设定并调节，常用的光照周期是每天12h～16h光照，8h～12h黑暗，用自动定时器控制。4.3湿度培养室的相对湿度一般控制在60%以内，超过时用除湿设备除湿。5培养基制备培养基母液及培养基配制按DB13/T2596中5.2、5.3执行。DB13/T5110—201946基本操作6.1清洗普通器皿用洗涤剂洗涤后，用自来水冲洗；新购入器皿，先用水清洗，再用1%盐酸浸泡2h～3h，最后清水冲洗。严重污垢难清洗器皿，水洗后用4%重铬酸钾洗液浸泡，最后清水冲洗。小件难清洗器皿亦可用超声波仪清洗。染菌器皿必须经121℃高压蒸汽灭菌后，倒掉污物洗涤。洗净的器皿应内外壁水膜均匀，不挂水珠，口朝下常温晾干或放入烘箱烘干。6.2灭菌与消毒6.2.1物理灭菌6.2.1.1湿热灭菌适用于培养基、蒸馏水、接种器具等，常用高压蒸汽灭菌，在0.1MPa压力下，即121℃，培养基灭菌15min～20min，其余物品30min。6.2.1.2干热灭菌适用于玻璃器皿及金属器械，可将物品用牛皮纸或布袋包扎好，置于恒温干燥箱（烘箱）中，160℃灭菌2h～3h。6.2.1.3灼烧灭菌适用于金属接种器具，先将镊子、剪子、解剖刀等浸入70%乙醇中，取出后在酒精灯火焰外焰灼烧1min左右，或将其尖端部分烧红为止；也可用280℃～320℃接种器具灭菌器灭菌1min～2min，省时、安全。6.2.1.4过滤除菌溶液通过0.22μm滤膜过滤，杂菌被阻，从而实现无菌。过滤除菌适用于高温不稳定的物质，如部分植物生长调节剂（赤霉素、玉米素、吲哚乙酸）、抗生素等。6.2.1.5射线灭菌常用于接种室、培养室等环境的灭菌，用260nm紫外线灯照射20min～30min。6.2.2化学灭菌6.2.2.1浸泡灭菌用于外植体材料的表面灭菌，常用的灭菌剂有70%乙醇20s～30s、5%次氯酸钠（2min～20min）、84消毒液（稀释2～5倍，5min～20min）、0.1%氯化汞2min～15min，有剧毒、尽量少用）。消毒剂中常加入0.1%表面活性剂吐温-20或吐温-80，增强灭菌效果。6.2.2.2喷雾灭菌常用70%乙醇在接种室、培养室等场所进行喷雾降尘及消毒和灭菌。6.2.2.3擦拭灭菌常用70%乙醇擦拭接种人员双手或桌面、超净工作台台面，用84消毒液、2%新洁尔灭拖擦地面。DB13/T5110—201956.2.2.4熏蒸灭菌利用设备直接放出杀菌气体或用氧化方法将化学试剂变为气体扩散到空气中杀灭微生物，如臭氧发生器释放臭氧（O3）、甲醛氧化熏蒸等方法。其中甲醛氧化熏蒸的效果好，但对人体和环境毒性大，不提倡常规使用。具体操作方法见附录C。6.3无菌接种操作及注意事项6.3.1对缓冲间和接种室全面清洁，紫外灯照射灭菌。6.3.2操作人员在接种室的缓冲间更衣洗手。接种专用衣、帽、鞋要每周清洗，保持洁净，定期消毒和灭菌。6.3.3打开超净工作台和台上的紫外灯，20min～30min后关闭紫外灯上机，利用超净工作台提供的无菌环境接种。将纱布用70%乙醇浸湿，擦拭双手、超净工作台台面及内壁，或用手持喷雾器喷洒70%乙醇。6.3.4刀、镊、剪等接种工具用70%的乙醇浸泡或擦拭，再用电热接种器具灭菌器或酒精灯灼烧灭菌后，置器械架或搁置台上冷却至常温。注意接种工具尖端不要碰到器械架或搁置台，工具每使用一次，均需重新灭菌，防止交叉污染。6.3.5将已灭菌的外植体或无菌组培材料在培养皿或不锈钢盘中切分成合适大小。培养皿或不锈钢盘需事先高温灭菌，每接种一瓶试管材料要更换一个无菌的培养皿或不锈钢盘。6.3.6一只手倾斜持握培养瓶，另一只手的小指与无名指指缝（或无名指与中指的指缝）夹住培养瓶的棉塞或封口膜，慢慢打开并始终夹在手中（培养瓶盖可里面朝上放置于工作台面），用镊子夹取切分好的材料，以植物材料的形态学下端插入培养基，深度以材料可牢固竖立为宜，单芽茎段的芽体要露出培养基，接种叶片或叶块则平铺在培养基表面。6.3.7封好瓶口，标明材料名称、接种日期、处理方法等，放置培养室培养。6.3.8无菌操作期间，应经常用70%乙醇擦拭工作台面和双手。接种时戴口罩，头部及身体不可探入台内，并注意手臂不得在培养基、无菌材料、接种器械上方经过，手臂离开工作台后再次进入时需重新消毒。已灭菌的外植体、试管苗、接种工具以及封口材料接触瓶口的部分等不得接触双手、工作台面和器皿外壁等，防止造成污染。6.3.9接种完毕，及时清理工作台面和用具。关闭超净工作台。7消毒灭菌与日常管理7.1接种室7.1.1按照每15m2配置1根30w紫外灯的标准，每天用紫外灯照射杀菌1h，每周用臭氧发生器消毒2～3次，臭氧浓度应≥20mg/m3，作用时间应≥30min（按GB28232执行）。杀菌时人员切勿进入，注意安全。也可使用空气净化器，每3个月更换一次滤芯。7.1.2组培室污染率居高不下、一般消毒灭菌措施难以控制时可用甲醛熏蒸的办法。甲醛（40%）用量4ml/m3～8ml/m3，高锰酸钾用量2g/m3～4g/m3，在接种室地面中央放置耐热、耐腐蚀敞口容器，先放入高锰酸钾，再加入甲醛溶液，操作人员立即撤离，将房间密闭。3d～5d后，充分通风。DB13/T5110—201967.1.3其余按DB13/T2596中相关要求执行。7.2培养室7.2.1每周用紫外灯照射杀菌1h，每月用臭氧消毒1次；或使用空气净化器，每3个月更换一次滤芯。甲醛熏蒸具体要求同7.1.2。7.2.2其余按DB13/T2596中相关要求执行。7.3培养基制备室、洗涤室、灭菌室、工作区域走廊按DB13/T2596中相关要求执行。DB13/T5110—20197附录A（资料性附录）组培室各功能区面积比例及设计说明组培室各