DB34T 1364-2011 饲料中甲基睾丸酮的测定高效液相色谱法

ICS65.120B46DB34安徽省地方标准DB34/T1364—2011饲料中甲基睾丸酮的测定-高效液相色谱法DeterminationofMethyltestosteroneinfeed-Highperformanceliquidchromatography2011-03-16发布2011-04-16实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T1364—2011I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省畜牧兽医局提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽省兽药饲料监察所(安徽省畜产品质量安全检测中心)。本标准主要起草人：刘发全、丁在亮、张莉、许世富、刘红云、明文庆、蔡东东。DB34/T1364—20111饲料中甲基睾丸酮的测定-高效液相色谱法1范围本标准规定了以高效液相色谱（HPLC）测定饲料中甲基睾丸酮的方法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中甲基睾丸酮的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样3试样制备按GB/T14699.1采样，选取有代表性的饲料样品500ｇ，四分法缩减至100ｇ，磨碎，全部通过0.42mm孔径分析筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。4原理试样中的甲基睾丸酮先用甲醇溶液提取，固相萃取柱净化，用高效液相色谱仪测定，以外标法进行定量分析。5试剂和材料5.1除特殊说明外，本标准所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的二级水。5.2甲基睾丸酮标准品：纯度不低于98％。5.3甲醇，色谱纯。5.4磷酸。5.50.025mol/L磷酸溶液：量取1.8mL磷酸加水定容至1000mL。5.6提取液：甲醇：水=95:5。5.7洗脱液：甲醇：水=40:60。5.8固相萃取柱：中性氧化铝固相萃取柱150mg/6mL。5.9甲基睾丸酮标准贮备液：500μg/mL。准确称取50mg甲基睾丸酮标准品(精确至0.0002g于100mL棕色容量瓶中，用甲醇常温超声溶解，定容至刻度并摇匀，配制成标准贮备液，贮于4℃冰箱中，有效期90天。DB34/T1364—201125.10甲基睾丸酮标准工作溶液：分别精确吸取(5.8)中标准贮备液0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mL于100mL棕色容量瓶中，用洗脱液液（5.6）定容，配制成0、1.0、2.5、5.0、10、20、50μg/mL标准工作溶液。5.11流动相：甲醇：0.025mol/L磷酸溶液=70:30。5.12滤膜：0.45μm有机滤膜。6仪器和设备6.1高效液相色谱仪，配置二极管阵列检测器或紫外检测器。6.2分析天平：感量0.0002g。6.3真空泵(0.1Mpa)。6.4恒温水浴锅。6.5离心机：5000r/min。6.6超声波清洗机。6.7饲料粉碎机7分析步骤7.1提取准确称取试样(配合饲料5g，浓缩饲料2g，复合预混合饲料1g，精确至0.0002g于离心管中，加入甲醇:水溶液（5.5）25mL，超声提取30分钟后，4000r/min离心10min，上清液过滤备用。7.2净化先分别用3mL甲醇和3mL水对固相萃取柱（5.7）对进行活化，取7.1制成的备用液3.0mL上小柱，控制过柱速度不超过1.0mL/min，用3mL甲醇（5.6）洗脱，收集洗脱液过0.45μm滤膜(5.11)，上机测定。7.3色谱条件色谱柱：C18(4.6×250mm，5μm)，或相当的色谱柱；检测波长：254nm；流速：1.0mL/min；进样体积：10μL。7.4上机测定取标准工作液和样品试液分别注入高效液相色谱仪，记录谱图，按外标法以峰面积进行计算。8结果计算与表述按照下式计算试样中甲基睾丸酮的含量：1000mAs1000VCsAX×××××=.................................(1)式中：DB34/T1364—20113X——试样中甲基睾丸酮的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；A——试样溶液对应的色谱峰面积响应值；As——标准溶液对应的色谱峰面积响应值；V——定容体积，单位为毫升（mL）；Cs——标准溶液的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；m——试样质量，单位为克（g）。平行测定结果用算术平均值表示，结果保留三位有效数字。9检测方法灵敏度、准确度、精密度9.1灵敏度本方法饲料中甲基睾丸酮检测限为1.0mg/kg。9.2准确度本方法在添加浓度为2.0mg/kg的回收率为80％～120％。9.3精密度本方法的批内变异系数CV≤10％，批间变异系数CV≤15％。DB34/T1364—20114AA附录A（资料性附录）甲基睾丸酮标准品高效液相色谱图图A.1甲基睾丸酮标准品高效液相色谱图_________________________________