DB34T 3208-2018 羊传染性脓疮病毒分离鉴定技术规程

ICS11.220B41DB34安徽省地方标准DB34/T3208—2018羊传染性脓疮病毒分离鉴定技术规程TechnicalRegulationforIsolationandIdentificationofGoatContagiousEcthymaVirus文稿版次选择2018-10-20发布2018-11-20实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T3208—2018I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽农业大学提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽农业大学、安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽东方帝维生物制品股份有限公司、安徽省动物卫生监督所、阜阳市动物卫生监督所、亳州市谯城区畜牧兽医局、旌德县畜牧兽医局、阜南县动物疫病预防与控制中心、肥东县动物疫病预防与控制中心、宿州市动物疫病预防与控制中心本标准主要起草人：王桂军、占松鹤、李雪松、祁克宗、朱良强、张星、张利亚、涂健、徐前明、方保根、冯育宁、陈静、郑举、方定平、兰梦蝶、刘雪梅、周迎春、王军、王楠楠、杨德康、车跃光。DB34/T3208—20181羊传染性脓疮病毒分离鉴定技术规程1范围本标准规定了羊传染性脓疮病毒病料采集与处理、病毒分离及病毒鉴定技术要点。本标准适用于羊传染性脓疮病毒的分离与鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3试验材料、试剂和仪器3.1材料增殖表皮癌细胞（HeLa）、羊睾丸原代细胞（Lambtestiscells，LT）、DMEM培养基、M199液体培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、0.01mol/LpH7.0～7.4磷酸盐缓冲液（PBS）、青霉素、链霉素。3.2试剂DNA提取试剂盒、50×TAE缓冲液、琼脂糖。3.3仪器细胞培养箱、生物安全柜、高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、紫外凝胶成像系统。4样品采集与处理4.1样品的采集按照NY/T541的规定执行，无菌采集疑似羊传染性脓疮病毒感染的病羊口唇、蹄部痂皮。4.2样品的保存样品应置于-80℃冷冻保存。4.3样品的处理先将病料组织剪碎、研磨，用灭菌PBS与样品按体积质量比5﹕1匀浆，将样品匀浆冻存后再室温融解，反复三次。经5000r/min离心10min，取上清，并加入青霉素和链霉素，终浓度为2000IU/mL，0.22μm过滤除菌，置于-80℃待用。DB34/T3208—201825病毒分离5.1传代细胞培养使用DMEM培养液复苏HeLa细胞，取T25细胞培养瓶密度达到80％的单层HeLa细胞，弃去培养液，用灭菌PBS清洗三次，接种1mL处理好的样品，于5％CO2培养箱，37℃下吸附2h，期间每隔30min轻轻摇晃一次。弃去样品液，用灭菌PBS清洗三次，加入5mL细胞维持液（血清含量为2％），培养箱内继续培养5d。在培养过程中每日观察细胞病变（CPE）产生情况，如出现CPE（特征病变为：细胞间隙增大、细胞核固缩、细胞圆化脱落），收集细胞培养上清及细胞裂解液。同时设立空白对照（见图1）。A：病变的HeLa细胞；B：对照细胞图1接种后第72小时病变的HeLa细胞和对照细胞10×5.2原代细胞培养5.2.1原代细胞制作选择2～3月龄健康雄性绵羊，无菌摘取睾丸，并浸泡于含双抗的M199培养基中保存，将睾丸组织放入平皿中，剥弃髓鞘及白膜，除去脂肪层，用含双抗的灭菌PBS清洗2～3次，放入烧杯中将睾丸组织剪碎，用含双抗的灭菌PBS清洗直至液体清亮，弃去液体，将组织倒入装有玻璃珠的三角瓶中，按组织量的4倍加入胰酶消化液，37℃消化30min，至睾丸组织呈蓬松状，加入M199培养液清洗，将胰酶消化液彻底冲洗干净，加入适量生长液（含10％血清的M199培养基），用玻璃珠振荡法分散细胞，6层纱布进行过滤，取滤液进行细胞计数，用生长液将细胞密度调整为100～150万个/mL的细胞悬液，7mL/瓶（T25细胞培养瓶），置37℃、5％CO2培养箱中进行培养。5.2.2病毒分离使用M199培养液培养LT细胞，取T25细胞培养瓶密度达到80％的单层LT细胞，弃去培养液，用灭菌PBS清洗三次，接种1mL处理好的样品，于5％CO2培养箱，37℃下吸附1h，期间每隔15min轻轻摇晃一次。吸附完成后，弃去样品液，用灭菌PBS清洗三次，加入5mL细胞维持液（血清含量为2％），培养箱内继续培养4d。在培养过程中每日观察CPE产生情况，如出现CPE，收集细胞培养上清及细胞裂解液。同时设立空白对照（见图2）。DB34/T3208—20183A：病变的羊睾丸原代细胞；B：对照细胞图2接种后第72小时病变的羊睾丸原代细胞和对照细胞100×6病毒PCR检测6.1引物B2Lgene上游引物：5’-CGGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTCCAT-3’B2Lgene下游引物：5’-CGGAATTCTTAATTTATTGGTTTGCAGAACTCC-3’6.2病毒DNA提取与PCR检测利用DNA提取试剂盒提取待测样品以及羊痘阳性病料DNA，以此作为PCR扩增模板。PCR扩增反应条件：94℃预变性3min；94℃45s，58℃45s，72℃70s，30个循环；最后72℃延伸10min。取PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶进行电泳检测，阳性结果为在1137bp处扩增出特异性条带（见图3）。图中：M——DL2000Marker；1——待检样品；2——羊痘阳性病料；3——阴性对照。图3B2L基因的PCR扩增7结果判定DB34/T3208—201847.1HeLa细胞接种病料72h后，开始出现细胞核固缩、细胞圆化脱落。7.2羊睾丸原代细胞接种病料72h后，开始出现细胞核固缩、细胞圆化脱落。7.3PCR检测结果得到与理论上B2L基因片段大小（1137bp）相符的目的条带大小目的片段时，且羊痘阳性病料未出现条带，初步判定为羊传染性脓疮病毒阳性，结果具有特异性。7.4符合结果判定7.3，且符合7.1或7.2时，可确诊被检羊感染羊传染性脓疮病毒。_________________________________