DB34T 3305-2018 石榴干腐病检测与鉴定技术规程

ICS65.020.20B16DB34安徽省地方标准DB34/T3305—2018石榴干腐病检测与鉴定技术规程DetectionandIdentificationofPilidiellagranati文稿版次选择2018-12-29发布2019-01-29实施安徽省市场监督管理局发布DB34/T3305—2018I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所提出。本标准由安徽省动植物检验检疫标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所，安徽省农业科学院园艺研究所，淮北市农业委员会，怀远县淮西石榴研究所，怀远县园艺站。本标准主要起草人：杨雪、徐义流、陈雨、秦改花、朱军、谷春艳、张爱芳、臧昊昱、高同春、戚仁德、刘长华、娄志。DB34/T3305—20181石榴干腐病检测与鉴定技术规程1范围本标准规定了石榴干腐病（pomegranatedryrot）的检测与鉴定技术。本标准适用于石榴的枝干、果实中石榴干腐病病菌的检测和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3石榴干腐病的症状与病原菌病原菌：石榴壳座月孢（Pilidiellagranati）分类地位：属真菌界Fungi，子囊菌门Ascomycota，子囊菌纲Sordariomycetes，间座壳目Diaporthales，黑盘孢科Melanconidaceae，壳座月孢属Pilidiella。其他信息参见附录A。4方法原理本方法以PCR鉴定和致病性鉴定为主要判定依据，石榴干腐病菌的形态特征作为辅助鉴定依据。5仪器设备5.1高速离心机：转速≤15000r/min5.2涡旋振荡器5.3PCR仪5.4高压灭菌锅5.5恒温培养箱：20℃～30℃5.6冰箱：4℃、-20℃、-70℃5.7恒温水浴锅：4℃～100℃5.8电泳仪5.9凝胶成像仪5.10可调移液器：1-10μL，10μL-100μL，100μL-1000μL5.11天平：精度0.001g5.12纯水仪5.13超净工作台DB34/T3305—201825.14显微镜：物镜头10×～40×6试剂和培养基6.1PCR试剂：2×PCRTaqMasterMix6.2凝胶电泳试剂：琼脂糖、TAE电泳缓冲液（Tris4.84g，Na2EDTA·2H200.75g，冰乙酸1.142mL，蒸馏水1000mL，pH8.5）6.3DNA提取试剂：CTAB提取液（Tris-HCl(pH8.0)100mmol/L，EDTA20mmol/L，NaCl1.4mol/L，CTAB2％(w/v)，蒸馏水1000mL，巯基乙醇(用时加入)40mmol/L），无水乙醇，10％SDS，酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），氯仿，异丙醇，TE（Tris-HCL10mmol/L，EDTA1mmol/L，pH8.0）6.4培养基：WA培养基（琼脂粉20g，水1000mL）、PDA培养基（去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，琼脂粉20g）6.5除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682中三级水的标准。7实验室鉴定7.1病原菌分离与纯化将石榴病果用75％乙醇表面消毒后，用无菌水清洗1次，于病健交界处取少量组织置于WA培养基中培养。待长出菌丝后，转至PDA培养基平板上，28℃恒温培养，并观察培养性状（参见附录A.2）和孢子形态（参见附录A.3）。进行单孢分离与纯化后，用于PCR鉴定。7.2PCR鉴定7.2.1病原菌DNA提取从培养好的菌落边缘用打孔器取10块直径为5mm的菌碟，转至PDA液体培养基，28℃振荡培养5d，过滤收集菌丝，经液氮冷冻研磨成粉，加入900μL2％CTAB提取液和90μL10％SDS，涡旋混匀，于60℃水浴1h，期间每隔10min上下颠倒几次，常温条件下12000rpm离心10min；取上清，加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，常温条件下12000rpm离心5min；将上清转移至新的EP管中，加入等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，常温条件下12000rpm离心5min；上清转移至新EP管中，加入1倍于上清体积的异丙醇，-20℃条件沉淀15min；常温条件下12000rpm离心5min，倾去上清，沉淀用70％乙醇洗涤2次，37℃条件下待乙醇挥发干；加适量灭菌超纯水或者TE（pH8.0）溶解沉淀（含20μg/mlRNase），37℃消解30min后电泳检测，-20℃保存备用。7.2.2PCR引物利用GenBank通过序列分析比较，根据ITS序列差异设计一对特异性引物。——GF-F：5’-AAGGACACAACCCCAGATAC-3’；——GF-R：5’-ATAAACTACTACGCTCAGAG-3’。7.2.3PCR体系反应体系为：2×PCRTaqMasterMix25μL，10μmol/L引物各2μL、DNA4μL，灭菌双蒸水补足至50μL。7.2.4PCR程序DB34/T3305—20183反应程序为：94℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。7.2.5PCR结果判定PCR鉴定用标准石榴干腐病菌DNA作阳性对照，无菌水作阴性对照。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶在1×TAE缓冲液中电泳，用凝胶成像系统分析。若阳性对照出现一条450bp的DNA片段，阴性对照没有条带，待鉴定菌株能扩增出该450bp的片段，则判定为石榴干腐病。7.3致病性鉴定根据科赫氏法则，用分离鉴定的石榴干腐病病原菌接种健康的石榴果实组织诱导发病，观察发病症状与田间石榴干腐病自然发病症状是否一致。将发病果实进行病原菌的分离与鉴定，观察分离的病原菌与接种病原菌是否一致。8结果判定如PCR鉴定结果符合7.2.5，且致病性鉴定结果符合7.3，则判定为检出石榴干腐病。9样品、菌株保存9.1样品保存检疫鉴定后保存样品，以备复验、谈判和仲裁。由鉴定人标识确认、样品管理员登记，置于-70℃冰箱保存。保存期为一年，有特殊需求保存期可适当延长。保存期满灭活处理。9.2菌株保存分离并鉴定为石榴干腐病菌的菌株，应妥善保存。短期保存可将菌株接种到PDA培养基斜面上，28℃培养3d，直接置于4℃冰箱保存。长期保存可将菌株接种到PDA培养基上，28℃培养3d，将菌丝体制成冻干粉，置于-70℃冰箱保存。对不需要保存的菌株应及时灭活处理。DB34/T3305—20184AA附录A（资料性附录）石榴干腐病的基本信息A.1分布在我国山东、安徽、河南、陕西、四川等产区均有发生。A.2病害症状以果实为害为主，在蕾期、花期发病，花冠变褐，花萼产生黑褐色椭圆形凹陷小斑。幼果发病首先在表面发生豆粒状大小不规则浅褐色病斑，逐渐扩为中间深褐，边缘浅褐的凹陷病斑，再深入果内，直至整个果实变褐腐烂，在花期和幼果期严重受害后造成早期落花落果；果实膨大期至初熟期，则不再落果，而干缩成僵果悬挂在枝梢（见图A.1）。图A.1石榴干腐病为害果实症状A.3病原菌培养性状PDA培养基上培养3～4天后，长出绒毛状白色菌落，同心轮纹状，菌落呈放射状生长，约7天后产生黑褐色分生孢子器（见图A.2）。分生孢子呈纺锤形，淡褐色，表面光滑，直或微弯，无隔膜，10～15μm×2.5～3.5μm（见图A.3）。DB34/T3305—20185图A.2石榴干腐病菌的培养形态特征图A.3石榴干腐病菌的孢子形态特征_________________________________