DB34T 3474-2019 饲料中黄芩苷的测定 高效液相色谱法

ICS65.120B46DB34安徽省地方标准DB34/T3474—2019饲料中黄芩苷的测定高效液相色谱法Determinationofbaicalininfeeds-Highperformanceliquidchromatography文稿版次选择2019-12-25发布2020-01-25实施安徽省市场监督管理局发布DB34/T3474—2019I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽安丰堂动物药业有限公司、安徽省兽药饲料监察所、东至县畜牧兽医局、安徽省动物疫病预防与控制中心、阜阳市动物卫生监督所。本标准起草人：刘发全、何宗来、周宏华、谢军池、明文庆、陈文帮、王群、丁常宏。DB34/T3474—20191饲料中黄芩苷的测定高效液相色谱法1范围本标准规定了饲料中黄芩苷含量测定的高效液相色谱法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中黄芩苷含量测定。本方法检测限为1.0mg/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样GB/T20195动物饲料试样的制备3原理试样中的黄芩苷用甲醇水溶液超声提取，经离心、过滤后的试样溶液注入高效液相色谱系统中进行分离，用紫外检测器检测，外标法计算黄芩苷的含量。4试剂和材料4.1除特殊说明外，本方法所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水，色谱用水为去离子水，符合GB/T6682中一级用水规定。4.2甲醇：色谱纯。4.3乙腈：色谱纯。4.4甲醇水溶液：50％（V+V)。4.5磷酸。4.6流动相A：磷酸溶液（0.025mol/L）。4.7流动相B：乙腈。4.8黄芩苷：CAS号21967-41-9，纯度≥98.0％。4.9黄芩苷标准溶液的制备4.9.1黄芩苷标准溶液贮备液：精确称取20mg黄芩苷标准品(精确至0.01mg)于200mL容量瓶中，用流动相（4.6）溶解，冷却，此溶液浓度为100μg/mL。置于4℃冰箱中保存，有效期60天。4.9.2黄芩苷标准工作溶液：分别吸取贮备液（4.9.1）1mL、2mL、5mL、10mL、20mL于100mL容量瓶中，用甲醇定容，标准工作溶液系列浓度分别为1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL。5仪器和设备DB34/T3474—201925.1高效液相色谱仪(配紫外检测器)。5.2分析天平：感量0.1mg、0.01mg。5.3离心机：≥3000r/min。5.4超声波仪。5.5分析筛：孔径0.42mm。5.6粉碎机。5.7微孔滤膜：孔径0.45μm尼龙滤膜。6试样的制备按GB/T14699.1的规定采样，选取有代表性饲料样品500ｇ以上，四分法缩减至100ｇ；按GB/T20195的规定制备样品，磨碎，全部通过分析筛(5.5)，混匀，装入磨口瓶中备用。7分析步骤7.1试样的提取7.1.1称取试样适量（配合饲料5.0g、浓缩饲料3.0g、预混合饲料1.0g），精确至0.001g，置于100mL磨口三角烧瓶中，准确加入甲醇溶液（4.4）50mL，置于超声波仪（5.4）超声提取30min。7.1.2取试样提取液（7.1.1）20mL转移至离心管，3000r/min，离心10min，取离心上清液2mL，用0.45μm尼龙滤膜过滤，滤液作为试样溶液上机测定，同时进行两份平行试验。7.2参考色谱条件7.2.1色谱柱：C18型柱，长250mm，内径4.6mm，粒径5μm，或相当性能C18柱；7.2.2检测波长：277nm；7.2.3流动相：A：磷酸溶液（0.025mol/L）B：乙腈，梯度淋洗，见表1；7.2.4流速：1.0mL/min；7.2.5柱温：室温；7.2.6进样体积：20μL。7.3测定黄芩苷标准工作溶液(4.9.2)和试液（7.1.2）分别进样得到色谱峰面积响应值，按表1进行高效液相色谱淋洗梯度洗脱，在线性范围内，用外标法校正，测定，以保留时间定性，峰面积定量。黄芩苷标准色谱图参见附录A中图A.1。表1流动相梯度淋洗表时间/minA：磷酸溶液/％B：乙腈/％0.0084.016.012.0084.016.016.0068.032.023.0068.032.027.0084.016.030.0084.016.0DB34/T3474—201937.4结果的计算与表述7.4.1计算公式结果按式(1)计算：...............................(1)式中：X——试样中黄芩苷含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；C——试液色谱峰对应的黄芩苷浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；m——试样质量，单位为克（g）；V——定容体积，单位为毫升（mL）f——稀释倍数。7.4.2结果表示平行测定2次，结果用算术平均值表示，计算结果保留3位有效数字。8精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。DB34/T3474—20194AA附录A（资料性附录）黄芩苷标准溶液的液相色谱图图A.1黄芩苷标准溶液液相色谱图_________________________________