DB41T 706-2011 猪传染性胃肠炎病毒与流行性腹泻病毒二重RT-PCR鉴别诊断试验方法

DB41河南省地方标准DB41/T706—2011猪传染性胃肠炎病毒与流行性腹泻病毒二重RT-PCR鉴别诊断试验方法2011-12-20发布2011-12-20实施河南省质量技术监督局发布DB41/T706—2011I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局提出并归口。本标准起草单位：河南省动物疫病预防控制中心。本标准起草人：吴志明、张志凌、闫若潜、赵明军、谢彩华、赵雪丽、刘梅芬。DB41/T706—20111猪传染性胃肠炎病毒与流行性腹泻病毒二重RT-PCR鉴别诊断试验方法1范围本标准规定了猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二重RT-PCR试验的样品采集、处理、存放及运输、操作方法及结果判定。本标准适用于对疑似感染猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒的猪肠组织、胃肠道粘膜、肠内容物或粪便等样品中病毒核酸进行检测。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1二重反转录聚合酶链式反应(二重RT-PCR)二重RT-PCR是在同一反转录体系内加入两条分别针对二种病毒相应基因序列的反转录引物进行反转录，在同一PCR反应混合液中加入两对分别针对二种病毒相应基因序列的特异性引物进行PCR扩增，通过一次PCR反应，可同时扩增出二种病毒相应核酸片段的RT-PCR反应。3试剂和仪器设备3.1试剂3.1.1除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯。提取RNA所用试剂均应使用无RNA酶的容器进行分装。3.1.2组织悬液、粪便及肛门拭子悬液（见附录A）常温保存。3.1.3裂解液（TriZol）、氯仿，1×核酸电泳缓冲液、0.01mol·L-1（pH7.2）的PBS、焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水（见附录A）2℃～8℃保存。3.1.4异丙醇，75%乙醇、DNA分子量标准、6×电泳上样缓冲液均－15℃以下保存。3.1.5阳性对照样品、阴性对照样品见附录A。3.1.6RT-PCR扩增用上、下游引物序列参见附录B。3.1.7猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二重RT-PCR反应混合液组成、说明及使用注意事项参见附录C。3.2仪器设备PCR扩增仪，高速冷冻离心机（离心力应在12000g以上），电泳仪和水平电泳槽，恒温水浴锅，DB41/T706—201122℃～8℃冰箱，－20℃冰箱，单道微量移液器（0.5µL～10µL；2µL～20µL；20µL～200µL；100µL～1000µL），组织匀浆器或研钵，凝胶成像系统(或紫外透射仪)。4样品的采集、处理、存放及运输4.1样品的采集及处理4.1.1组织样品用无菌的剪刀剪取猪小肠组织0.5g于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，或用刀片刮取病死猪胃肠道粘膜放入无菌1.5mL离心管中，加0.3mL～0.5mL组织悬液混匀，将组织悬液转入无菌1.5mL离心管中，4℃条件下5000r·min-1离心10min，取上清转入新的无菌1.5mL离心管中，编号备用。4.1.2肠内容物样品无菌取小肠内容物样品3g，置于无菌离心管中，加0.5mL～1.0mL肠内容物悬液混匀，4℃条件下5000r·min-1离心10min，取上清转入新的无菌1.5mL离心管中，编号备用。4.1.3肛门拭子样品将棉拭子深入猪肛门内2cm～3cm轻轻旋转3～5圈，放入盛有1.0mL拭子悬液的1.5mL离心管中，然后将拭子悬液转入无菌1.5mL离心管中，4℃条件下5000r·min-1离心10min，取上清转入新的无菌1.5mL离心管中，编号备用。4.2存放与运送采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h，密封后，冷藏保存，及时运送到实验室。若需长期保存，应放置于－40℃以下处冷冻保存，应避免反复冻融。5操作方法5.1样品RNA的制备5.1.1取1.5mL灭菌离心管，每管加入300µL裂解液，分别加入待测样品、阴性对照样品、阳性对照样品各100µL，吸头反复吸打混匀（一份样品换用一个吸头）；再加入100µL氯仿，充分颠倒混匀（不宜过于强烈）；于4℃条件下，12000r·min-1离心15min。5.1.2吸取离心后各管中的上清液150µL转移至新的1.5mL灭菌离心管中（不要吸出中间层），加入150µL－20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置15min。5.1.34℃条件下12000r·min-1离心15min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应置于吸水纸不同地方沾干。加入1mL75%乙醇，轻轻颠倒洗涤。DB41/T706—201135.1.44℃条件下12000r·min-1离心5min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体，不同样品应在吸水纸不同地方沾干。5.1.54℃条件下12000r·min-1离心30s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，真空抽干3min～5min或室温干燥10min。5.1.6加入21µLDEPC处理水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r·min-1离心5s，冰上保存备用。提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增或放置于－70℃冰箱备用。5.2反转录（cDNA的合成）配制反转录反应混合液（反转录反应混合液组成参见附录C.2.1），向每管中分别加入5.1.6中相应RNA10µL，并对每个管进行相应的编号，37℃水浴1h或置于PCR仪中37℃1h，反应结束后，70℃15min灭活反转录酶，直接用于下面的PCR扩增或－20℃冻存备用。5.3二重PCR扩增配制PCR反应混合液（PCR反应混合液组成参见附录C.2.2），在室温下融化后，瞬时离心使液体全部聚集在管底部，向每管中加入5.2中相应cDNA的4µL，经充分混匀后瞬时离心使液体全部聚集于管底，加入25µL的石蜡油覆盖液面（若PCR仪具有热盖加热功能时PCR反应管中也可不加石蜡油），并对每个管进行相应的编号。PCR扩增条件：95℃预变性5min后，94℃45s，51℃45s，72℃45s共35个循环，最后72℃延伸10min。扩增反应结束后取出放置于2℃～8℃。5.4PCR扩增产物的电泳检测称取1.2g琼脂搪加入100mL核酸电泳缓冲液中，加热充分溶化后稍放凉，加入适量的溴化乙锭(终浓度0.5μg·mL-1)，倒入胶槽制备凝胶板。在电泳槽中加入核酸电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取5µL～10µLPCR扩增产物分别和1µL～2µL的6×上样缓冲液混合后，分别加样到凝胶孔。5V/cm恒压下电泳30min。将电泳好的凝胶放到紫外透射仪或凝胶成像系统上观察结果，进行判定并做好试验记录。6结果判定6.1试验结果成立条件猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒阳性对照的PCR产物，经电泳后在869bp和448bp位置同时出现特异性条带，同时阴性对照PCR产物电泳后没有任何条带，则检测试验结果成立，否则结果不成立（参见附录D）。6.2阳性判定DB41/T706—20114在试验结果成立的前提下，如果待检样品的PCR产物电泳后在869bp和448bp的位置上同时出现特异性条带，判定为猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒核酸检测双阳性；若869bp位置出现特异条带而448bp位置无特异条带，判定为猪传染性胃肠炎病毒核酸检测阳性；若448bp位置出现特异条带而869bp位置无特异条带，判定为猪流行性腹泻病毒核酸检测阳性（参见附录D）。6.3阴性判定在试验结果成立的前提下，待检样品的PCR产物电泳后在869bp和448bp位置均未出现特异性条带，判定为猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒核酸检测阴性（参见附录D）。DB41/T706—20115附录A（规范性附录）试剂的配制A.1组织、肠内容物悬液：在0.01mol·L-1PBS液中添加青霉素(2000IU·mL-1)，链霉素(2mg·mL-1)、庆大霉素(50pg·mL-1)和制霉菌素(1000IU·mL-1)。A.2拭子悬液：在0.01mol·L-1PBS液中添加组织悬液所有的抗生素，浓度提高5倍；加入抗生素后调pH值至7.2～7.4。A.31×核酸电泳缓冲液：Tris碱，24.2g；冰乙酸，5.71mL；0.5mol·L-1EDTA(pH8.0)，10mL；加去离子水定容至100mL，使用时用去离子水作50倍稀释，即为1×核酸电泳缓冲液。A.40.01mol·L-1（pH7.2）的磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：a)A液（0.2mol·L-1磷酸二氢钠水溶液）：NaH2PO4·H2O27.6g，先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释并定容至1000mL。b)B液（0.2mol·L-1磷酸氢二钠水溶液）：Na2HPO4·7H2O53.6g，（或Na2HPO4·12H2O71.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g）先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释并定容至1000mL。c)0.01mol·L-1PBS的配制：A液14mL，B液36mL，加NaCl8.5g，最后用蒸馏水稀释并定容至1000mL；121℃，15min高压灭菌，4℃保存备用。A.5DEPC处理水：用0.1%DEPC处理后的蒸馏水，经121℃15min高压处理，用于溶解RNA。A.6阳性对照样品：经灭活的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎病毒细胞培养毒。A.7阴性对照样品：正常细胞培养液。DB41/T706—20116AA附录B（资料性附录）猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二重RT-PCR试验所用引物猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二重RT-PCR试验所用引物见表B.1。表B.1猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二重RT-PCR试验所用引物引物名称引物浓度引物序列PCR扩增上游引物TGEV-P120μmol·L-15'-TCATTCTTCAACCCCATAAC-3'PCR扩增下游引物TGEV-P220μmol·L-15'-AAGGAATTGTCCAGTCTTAG-3'PCR扩增上游引物PEDV-P120μmol·L-15'-CTGCGTTCTTGTATGGTGT-3'PCR扩增下游引物PEDV-P220μmol·L-15'-TGAAGCATTGACTGAACGAC-3'DB41/T706—20117BB附录C（资料性附录）猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二重RT-PCR试验反应混合液组成、说明C.1猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二重RT-PCR试验反应混合液组成猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二重RT-PCR试验反应混合液组成见表C.1。表C.1猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二重RT-PCR试验反应混合液组成C.2说明C.2.1反转录反应混合液成份含：M-MLV5×Reactionbuffer(含Mg2+)，4µL；2.5mMdNTPs，4µL；M-MLV，0.5µL；RNA酶抑制剂，0.5µL；反转录引物（TGEV-P20.5µL，PEDV-P20.5µL）1µL；总体积10µL。C.2.2二重PCR反应混合液成分：10×PCR缓冲液(含Mg2+)，2.5µL；2.5mMdNTPs，2µL；TGEV-P1，0.5µL；TGEV-P2，0.5µL；PEDV-P1，0.5µL；PEDV-P2，0.5µL；TaqDNA聚合酶，0.25µL；水，14.25µL；总体积为21µL。C.2.3裂解液的主要成分是TriZol，为RNA提取试剂，外观为粉红色，于4℃保存。C.2.4DEPC水，用0.1%DEPC处理后的去离子水，经121℃15min高压处理，用于溶解RNA。C.2.5反转录反应混合液中分别含猪传染性胃肠炎或流行性腹泻病毒反转录引物、反转录酶及各种离组成成分数量反转录反应混合液20管(10L/管)PCR反应混合液20管(21L/管）阳性对照样品1mL阴性对照样品1mL裂解液6.5mL氯仿5.0mL异丙醇10mL75%乙醇20mLDEPC水1.4mL50倍TAE电泳缓冲液40mL溴化乙锭溶液40µL上样缓冲液150µL石蜡油2mLDB41/T706—20118子。C.2.6PCR反应混合液中含猪传染性胃