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ICS65.120B46DB41河南省地方标准DB41/T1587—2018饲料中大肠杆菌O157的检测EMA-PCR法2018-04-17发布2018-07-17实施河南省质量技术监督局发布DB41/T1587—2018I前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局提出并归口。本标准起草单位:河南省兽药饲料监察所、郑州大学。本标准主要起草人:方忠意、高延玲、李金磊、赵全成、陈小鸽、孟伟、魏法山。本标准参加起草人:董鹏、狄元冉、陈蔷、张艳娜、赵林萍、曾萍、张宁、王庆东、郑彬、李博、彭丽、张磊。DB41/T1587—20181饲料中大肠杆菌O157的检测EMA-PCR法1范围本标准规定了饲料中大肠杆菌O157的EMA-PCR检测方法。本标准适用于饲料中大肠杆菌O157的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB4789.6食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样3原理叠氮溴化乙锭(EMA)能够透过死细菌的细胞膜,在强光照射下可与其DNA发生不可逆转的结合,使死细菌DNA不能作为模板进行PCR扩增,而活菌能进行PCR扩增。4试剂和材料4.1除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂,试验用水符合GB/T6682一级水的要求。4.2营养肉汤:见附录A的A.1。4.3肠道增菌肉汤:见附录A的A.2。4.42×PremixTaq缓冲液:内含TaqDNA聚合酶1.25U/25μL,4mmolMg2+,dNTP各0.4mmol。4.5特异性引物(对)序列为:a)上游引物:5'-CAGGTGAAGGTGGAATGGTTGT-3';b)下游引物:5'-CTCTTTCCTCTGCGGTCCTAGTTA-3'。4.6琼脂糖:电泳级。4.7Marker2000。4.8大肠杆菌O157CICC21530。4.950×TAE缓冲液:见附录A的A.3。4.106×上样缓冲液:见附录A的A.4。4.11叠氮溴化乙锭(EMA,0.2mg/mL):见附录A的A.5。4.12溴化乙锭(10mg/mL)。4.13灭菌离心管:1.5mL,15mL。5仪器设备DB41/T1587—201825.1PCR仪。5.2电子天平:感量0.01g。5.3电热恒温培养箱。5.4离心机:转速≥12000r/min。5.5浊度仪。5.6卤素灯:照度≥25000勒克斯(Lux)。5.7核酸电泳仪。5.8凝胶成像系统。5.9微量移液器:0.5μL~10μL,10μL~100μL,100μL~1000μL,1mL~10mL。5.10涡旋仪。6样品采集与制备按GB/T14699.1的规定采样,将样品充分混匀后密封低温保存,整个过程避免人为污染。7检验步骤7.1增菌取25g试样于225mL营养肉汤(4.2)中,充分混匀,36℃±1℃培养6h进行预增菌,取10μL预增菌液转移至10mL肠道增菌肉汤(4.3)中,42℃±1℃培养18h。如果试样量不足25g,试样质量与增菌液的体积比应为1∶9。7.2模板的制备取1mL增菌液至离心管中,12000r/min离心2min,弃上清。加入1mL灭菌水悬浮沉淀物,12000r/min离心2min,弃上清,重复洗涤一次。加适量灭菌水悬浮沉淀物并调节菌悬液浓度至0.5麦氏单位(MCF)。取0.2mL菌悬液至离心管中,加入2μLEMA溶液(4.11)混匀,避光孵育5min。将离心管开盖置于冰上,卤素灯照射下曝光2min,然后水浴煮沸10min,再将离心管转移至冰浴中使其快速冷却。涡旋混匀裂解物,12000r/min离心2min,收集上清液,作为PCR扩增的模板(模板制备可选用等效的商品化试剂盒)。检测过程中分别设阳性对照和阴性对照,用添加大肠杆菌O157阳性标准菌株的样品作为阳性对照,用不含大肠杆菌O157的样品作为阴性对照。7.3PCR扩增采用50μL反应体系:2×PremixTaq缓冲液(4.4)25μL,模板5μL,浓度为20μmol/L的上、下游引物各1μL,灭菌水18μL。反应程序为:95℃预变性5min;35个循环:95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸40s;72℃终延伸5min后4℃保存。7.4电泳检测PCR扩增产物称取1.5g琼脂糖(4.6)加入100mL1×TAE电泳缓冲液(4.9)中,加热使其充分熔化,冷至65℃左右,加入5μL溴化乙锭(4.12),充分混匀,根据需要在模板内放入合适的梳子,倒入凝胶制成约5mm厚的胶块。在电泳槽中加入适量1×TAE缓冲液,使液面没过凝胶2mm左右。取PCR扩增产物5μL~8μLDB41/T1587—20183与1μL6×上样缓冲液(4.10)混合后加入到上样孔内,设Marker2000(4.7)对照。5V/cm~8V/cm恒压下电泳20min~30min。电泳结束后,将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪中观察结果。8结果判定8.1结果分析条件设定如果大肠杆菌O157阳性对照的PCR产物在318bp处出现条带(参见附录B),同时阴性对照PCR产物于318bp处未出现条带,则检测结果成立;否则结果无效,应重新进行检测。8.2阳性判定样品的PCR产物电泳后在318bp处出现条带,则为疑似阳性样品,此时需按GB4789.6进行确证,最终结果以后者检测结果为准。8.3阴性判定样品的PCR产物电泳后在318bp处未出现条带,判定25g样品中未检出大肠杆菌O157。DB41/T1587—20184AA附录A(规范性附录)培养基和试剂A.1营养肉汤A.1.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏3.0g氯化钠5.0g水1000mLA.1.2制法将以上成分混合加热溶解,冷却至25℃左右调节至pH7.4±0.2,分装适当的容器。121℃灭菌15min。A.2肠道增菌肉汤A.2.1成分蛋白胨10.0g葡萄糖5.0g牛胆盐20.0g磷酸氢二钠8.0g磷酸二氢钾2.0g煌绿0.015g水1000mLA.2.2制法将以上成分混合加热溶解,冷却至25℃左右调节至pH7.4±0.2,分装每管10mL。115℃灭菌20min。A.350×TAE电泳缓冲液A.3.1成分三羟甲基氨基甲烷(Tris)242.0g乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)37.2g冰乙酸57.1mL灭菌水942.9mLA.3.2制法DB41/T1587—20185Tris和乙二胺四乙酸二钠溶于800mL灭菌水,充分搅拌均匀;加入冰乙酸,充分溶解;用1mol/LNaOH调节至pH8.3,定容至1L后,室温保存。使用时稀释50倍即为1×TAE电泳缓冲液。A.46×上样缓冲液A.4.1成分溴酚蓝0.5g二甲苯氰FF0.5g0.5mol/L乙二胺四乙酸(EDTA,pH8.0)0.06mL甘油360mL灭菌水640mLA.4.2制法0.5mol/LEDTA(pH8.0)溶于500mL灭菌水中,加入溴酚蓝和二甲苯氰FF溶解,与甘油混合,定容至1000mL,分装后4℃保存。A.5叠氮溴化乙锭(EMA)A.5.1成分叠氮溴化乙锭5mg灭菌水25mLA.5.2制法5mg叠氮溴化乙锭溶于5mL灭菌水中,定容至25mL,充分混匀,分装后-20℃避光保存。DB41/T1587—20186BB附录B(资料性附录)大肠杆菌O157活菌EMA-PCR扩增电泳图大肠杆菌O157活菌EMA-PCR扩增电泳图参见图B.1。说明:M—Marker2000;1—阴性对照;2—阳性对照。图B.1大肠杆菌O157活菌EMA-PCR扩增电泳图_________________________________
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