GB 4789.40-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验

中华人民共和国国家标准GB4789.40—2016食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布GB4789.40—2016Ⅰ前言本标准代替GB4789.40—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验》、SN/T1632.1—2013《出口奶粉中阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)检验方法第1部分:分离与计数》。本标准与GB4789.40—2010相比,主要变化如下:———标准名称修改为“食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验”;———修改了可疑菌落的挑取数量。GB4789.40—20161食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验1范围本标准规定了食品中克罗诺杆菌属(Cronobacter)的检验方法。本标准适用于婴幼儿配方食品、乳和乳制品及其原料中克罗诺杆菌属的检验。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1恒温培养箱:25℃±1℃,36℃±1℃,44℃±0.5℃。2.2冰箱:2℃~5℃。2.3恒温水浴箱:44℃±0.5℃。2.4天平:感量0.1g。2.5均质器。2.6振荡器。2.7无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。2.8无菌锥形瓶:容量100mL、200mL、2000mL。2.9无菌培养皿:直径90mm。2.10pH计或pH比色管或精密pH试纸。2.11全自动微生物生化鉴定系统。3培养基和试剂3.1缓冲蛋白胨水(bufferpeptonewater,BPW):见A.1。3.2改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycinmedium,mLST-Vm):见A.2。3.3阪崎肠杆菌显色培养基。3.4胰蛋白胨大豆琼脂(trypticasesoyagar,TSA):见A.3。3.5生化鉴定试剂盒。3.6氧化酶试剂:见A.4。3.7L-赖氨酸脱羧酶培养基:见A.5。3.8L-鸟氨酸脱羧酶培养基:见A.6。3.9L-精氨酸双水解酶培养基:见A.7。3.10糖类发酵培养基:见A.8。3.11西蒙氏柠檬酸盐培养基:见A.9。GB4789.40—20162第一法克罗诺杆菌属定性检验4检验程序克罗诺杆菌属检验程序见图1。图1克罗诺杆菌属检验程序5操作步骤5.1前增菌和增菌取检样100g(mL)置灭菌锥形瓶中,加入900mL已预热至44℃的缓冲蛋白胨水,用手缓缓地摇动至充分溶解,36℃±1℃培养18h±2h。移取1mL转种于10mLmLST-Vm肉汤,44℃±0.5℃培养24h±2h。5.2分离5.2.1轻轻混匀mLST-Vm肉汤培养物,各取增菌培养物1环,分别划线接种于两个阪崎肠杆菌显色培养基平板,显色培养基须符合GB4789.28的要求,36℃±1℃培养24h±2h,或按培养基要求条件GB4789.40—20163培养。5.2.2挑取至少5个可疑菌落,不足5个时挑取全部可疑菌落,划线接种于TSA平板。25℃±1℃培养48h±4h。5.3鉴定自TSA平板上直接挑取黄色可疑菌落,进行生化鉴定。克罗诺杆菌属的主要生化特征见表1。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。表1克罗诺杆菌属的主要生化特征生化试验特征黄色素产生+氧化酶-L-赖氨酸脱羧酶-L-鸟氨酸脱羧酶(+)L-精氨酸双水解酶+柠檬酸水解(+)发酵D-山梨醇L-鼠李糖D-蔗糖D-蜜二糖苦杏仁甙(-)++++注:+99%阳性;-99%阴性;(+)90%~99%阳性;(-)90%~99%阴性。6结果与报告综合菌落形态和生化特征,报告每100g(mL)样品中检出或未检出克罗诺杆菌属。第二法克罗诺杆菌属的计数7操作步骤7.1样品的稀释7.1.1固体和半固体样品:无菌称取样品100g、10g、1g各三份,分别加入900mL、90mL、9mL已预热至44℃的BPW,轻轻振摇使充分溶解,制成1∶10样品匀液,置36℃±1℃培养18h±2h。分别移取1mL转种于10mLmLST-Vm肉汤,44℃±0.5℃培养24h±2h。7.1.2液体样品:以无菌吸管分别取样品100mL、10mL、1mL各三份,分别加入900mL、90mL、9mL已预热至44℃的BPW,轻轻振摇使充分混匀,制成1∶10样品匀液,置36℃±1℃培养18h±2h。分别移取1mL转种于10mLmLST-Vm肉汤,44℃±0.5℃培养24h±2h。GB4789.40—201647.2分离、鉴定同5.2和5.3。8结果与报告综合菌落形态、生化特征,根据证实为克罗诺杆菌属的阳性管数,查MPN检索表,报告每100g(mL)样品中克罗诺杆菌属的MPN值(见表B.1)。GB4789.40—20165附录A培养基和试剂A.1缓冲蛋白胨水(BPW)A.1.1成分蛋白胨10.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)9.0g磷酸二氢钾1.5g蒸馏水1000mLA.1.2制法加热搅拌至溶解,调节pH至7.2±0.2,121℃高压灭菌15min。A.2改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(Modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycinmedium,mLST-Vm)A.2.1改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨(mLST)肉汤A.2.1.1成分氯化钠34.0g胰蛋白胨20.0g乳糖5.0g磷酸二氢钾2.75g磷酸氢二钾2.75g十二烷基硫酸钠0.1g蒸馏水1000mLA.2.1.2制法加热搅拌至溶解,调节pH至6.8±0.2。分装每管10mL,121℃高压灭菌15min。A.2.2万古霉素溶液A.2.2.1成分万古霉素10.0mg蒸馏水10.0mLA.2.2.2制法10.0mg万古霉素溶解于10.0mL蒸馏水,过滤除菌。万古霉素溶液可以在0℃~5℃保存15d。GB4789.40—20166A.2.3改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(Modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycinmedium,mLST-Vm)每10mLmLST加入万古霉素溶液0.1mL,混合液中万古霉素的终浓度为10μg/mL。注:mLST-Vm必须在24h之内使用。A.3胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)A.3.1成分胰蛋白胨15.0g植物蛋白胨5.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g蒸馏水1000mLA.3.2制法加热搅拌至溶解,煮沸1min,调节pH至7.3±0.2,121℃高压15min。A.4氧化酶试剂A.4.1成分N,N,N',N'-四甲基对苯二胺盐酸盐1.0g蒸馏水100mLA.4.2制法少量新鲜配制,于冰箱内避光保存,在7d之内使用。A.4.3试验方法用玻璃棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落,涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸平板上。如果滤纸在10s中之内未变为紫红色、紫色或深蓝色,则为氧化酶试验阴性,否则即为氧化酶实验阳性。注:实验中切勿使用镍/铬材料。A.5L-赖氨酸脱羧酶培养基A.5.1成分L-赖氨酸盐酸盐(L-lysinemonohydrochloride)5.0g酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g溴甲酚紫0.015g蒸馏水1000mLA.5.2制法将各成分加热溶解,必要时调节pH至6.8±0.2。每管分装5mL,121℃高压15min。GB4789.40—20167A.5.3实验方法挑取培养物接种于L-赖氨酸脱羧酶培养基,刚好在液体培养基的液面下。30℃±1℃培养24h±2h,观察结果。L-赖氨酸脱羧酶试验阳性者,培养基呈紫色,阴性者为黄色,空白对照管为紫色。A.6L-鸟氨酸脱羧酶培养基A.6.1成分L-鸟氨酸盐酸盐(L-ornithinemonohydrochloride)5.0g酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g溴甲酚紫0.015g蒸馏水1000mLA.6.2制法将各成分加热溶解,必要时调节pH至6.8±0.2。每管分装5mL。121℃高压15min。A.6.3实验方法挑取培养物接种于L-鸟氨酸脱羧酶培养基,刚好在液体培养基的液面下。30℃±1℃培养24h±2h,观察结果。L-鸟氨酸脱羧酶试验阳性者,培养基呈紫色,阴性者为黄色。A.7L-精氨酸双水解酶培养基A.7.1成分L-精氨酸盐酸盐(L-argininemonohydrochloride)5.0g酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g溴甲酚紫0.015g蒸馏水1000mLA.7.2制法将各成分加热溶解,必要时调节pH至6.8±0.2。每管分装5mL。121℃高压15min。A.7.3实验方法挑取培养物接种于L-精氨酸脱羧酶培养基,刚好在液体培养基的液面下。30℃±1℃培养24h±2h,观察结果。L-精氨酸脱羧酶试验阳性者,培养基呈紫色,阴性者为黄色。A.8糖类发酵培养基A.8.1基础培养基A.8.1.1成分酪蛋白(酶消化)10.0gGB4789.40—20168氯化钠5.0g酚红0.02g蒸馏水1000mLA.8.1.2制法将各成分加热溶解,必要时调节pH至6.8±0.2。每管分装5mL。121℃高压15min。A.8.2糖类溶液(D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙)A.8.2.1成分糖8.0g蒸馏水100mLA.8.2.2制法分别称取D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙等糖类成分各8g,溶于100mL蒸馏水中,过滤除菌,制成80mg/mL的糖类溶液。A.8.3完全培养基A.8.3.1成分基础培养基875mL糖类溶液125mLA.8.3.2制法无菌操作,将每种糖类溶液加入基础培养基,混匀;分装到无菌试管中,每管10mL。A.8.4实验方法挑取培养物接种于各种糖类发酵培养基,刚好在液体培养基的液面下。30℃±1℃培养24h±2h,观察结果。糖类发酵试验阳性者,培养基呈黄色,阴性者为红色。A.9西蒙氏柠檬酸盐培养基A.9.1成分柠檬酸钠2.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钾1.0g磷酸二氢铵1.0g硫酸镁0.2g溴麝香草酚蓝0.08g琼脂8.0g~18.0g蒸馏水1000mLA.9.2制法将各成分加热溶解,必要时调节pH至6.8±0.2。每管分装10mL,121℃高压15min,制成斜面。GB4789.40—20169A.9.3实验方法挑取培养物接种于整个培养基斜面,36℃±1℃培养24h±2h,观察结果。阳性者培养基变为蓝色。GB4789.40—201610附录B克罗诺杆菌属最可能数(MPN)检索表每100g(mL)检样中克罗诺杆菌属最可能数(MPN)的检索见表B.1。表B.1克罗诺杆菌属最可能数(MPN)检索表阳性管数100101MPN95%可信限下限上限阳性管数100101MPN95%可信限下限上限0000.3—0.952202.10.454.20010.30.0150.962212.80.879.40100.30.0151.12223.50.879.40110.610.121.82302.90.879.40200.620.121.82313.60.879.40300.940.363.83002.30.469.41000.360.0171.83013.80.87111010.720.131.83026.41.7181021.10.363.83104.30.9181100.740.1323117.51.7201111.10.363.8312123.7421201.10.364.2313164421211.50.454.23209.31.8421301.60.454.2321153.7422000.920.143.8322214432011.40.364.232329910020220.454.2330244.21002101.50.374.233146920021120.454.2332110184102122.70.879.43331104