GB 4789.41-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 肠杆菌科检验

中华人民共和国国家标准GB4789.41—2016食品安全国家标准食品微生物学检验肠杆菌科检验2016-08-31发布2017-03-01实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布GB4789.41—20161食品安全国家标准食品微生物学检验肠杆菌科检验1范围本标准规定了食品中肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的检验方法。本标准第一法适用于肠杆菌科含量较高的食品中肠杆菌科的计数;第二法适用于肠杆菌科含量较低食品中肠杆菌科的计数。2术语和定义2.1肠杆菌科Enterobacteriaceae在给定条件下发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。2.2肠杆菌科计数EnumerationofEnterobacteriaceae按本标准规定方法,对每克或每毫升检样中的肠杆菌科进行计数。2.3最可能数mostprobablenumber;MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。3设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:3.1恒温培养箱:36℃±1℃。3.2冰箱:2℃~5℃。3.3水浴箱:46℃±1℃。3.4天平:感量0.1g。3.5显微镜:10倍~100倍。3.6均质器。3.7振荡器。3.8无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。3.9无菌锥形瓶或等效容器:容量150mL、500mL。3.10无菌培养皿:直径90mm。3.11无菌试管:18mm×180mm、15mm×150mm。3.12pH计或pH比色管或精密pH试纸。4培养基和试剂4.1缓冲蛋白胨水(BPW):见B.1。GB4789.41—201624.2缓冲葡萄糖煌绿胆盐肉汤(EE肉汤):见B.2。4.3结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA):见B.3。4.4营养琼脂(NA):见B.4。4.5葡萄糖琼脂:见B.5。4.6革兰氏染色液:见B.6。4.7氧化酶试剂:见B.7。4.8无菌1mol/LNaOH:见B.8。4.9无菌1mol/LHCl:见B.9。第一法肠杆菌科平板计数法5检验程序肠杆菌科平板计数法检验程序见图1。图1肠杆菌科平板计数法检验程序GB4789.41—201636操作步骤6.1样品的稀释6.1.1固体和半固体样品:称取25g样品放入盛有225mLBPW的无菌均质杯中,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mLBPW的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。6.1.2液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品放入盛有225mLBPW的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1∶10的样品匀液。6.1.3用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入盛有9mLBPW的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不应触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。6.1.4按6.1.3操作程序,依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。6.2倾注平板和培养6.2.1根据对样品污染状况的估计及相关限量要求,选择2个~3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种2个无菌平皿。同时,分别吸取1mLBPW加入两个无菌平皿内作为空白对照。6.2.2将10mL~15mL冷却至46℃的VRBGA(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注于每个平皿中。小心旋转平皿,使样品匀液与培养基充分混匀。6.2.3待琼脂凝固后,倾注一薄层同样的培养基覆盖平板表层。防止蔓延生长并使菌落特征更为明显。6.2.4待VRBGA平板上层琼脂凝固后翻转平板,36℃±1℃培养18h~24h。6.3典型菌落计数和确认6.3.1肠杆菌科典型菌落为有或无沉淀环的粉红色至红色或紫色菌落。选取典型菌落数在15CFU~150CFU之间、无蔓延菌落生长的平板,只计数典型菌落数。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits,CFU)表示。6.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。6.3.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。6.3.4从每个平板上至少挑取5个(小于5个全选)典型菌落进行确认;如果有不同形态的典型菌落,则每种形态分别至少挑取1个菌落进行确认。6.3.5典型菌落的确认:a)分别将所挑选的每一个菌落,划线于营养琼脂平板,36℃±1℃培养18h~24h,挑取平板上的菌落进行革兰氏染色镜检、氧化酶试验及葡萄糖发酵试验。b)革兰氏染色镜检:肠杆菌科为革兰氏阴性杆菌,无芽孢,大小为(0.3~1.0)μm×(1.0~6.0)μm。c)氧化酶试验:用铂/铱接种环或玻璃棒(不要用镍铬接种环)挑取单个菌落涂于浸湿氧化酶试剂GB4789.41—20164的滤纸上,滤纸的颜色在10s内变成蓝紫色,判为阳性反应。d)葡萄糖发酵试验:用接种针挑取少许氧化酶阴性的同一个菌落,穿刺于葡萄糖琼脂内,于36℃±1℃培养24h±2h,若试管内的内容物变为黄色,判为阳性反应。6.4结果的计算6.4.1一般原则若有两个连续稀释度的平板典型菌落数在适宜计数范围内,按式(1)计算,示例见A.1、A.2、A.3、A.4。N=∑a(n1+0.1n2)d…………………………(1)式中:N———样品中肠杆菌科菌落数;∑a———确证的肠杆菌科菌落数之和;n1———第一稀释度(低稀释倍数)平板个数(含确证的肠杆菌科菌落);n2———第二稀释度(高稀释倍数)平板个数(含确证的肠杆菌科菌落);d———稀释因子(第一稀释度)。其中,a按式(2)计算:a=bA×C…………………………(2)式中:a———确证的肠杆菌科菌落数;b———某一平板中A个菌落中被确证为肠杆菌科的菌落数,b≤A;A———某一平板中用于确认试验的菌落数;C———某一平板中典型菌落总数。6.4.2低菌落数若最低稀释度(包括液体样品原液)平板的典型菌落数均小于15CFU,具有确证的肠杆菌科菌落,则以确证的菌落数乘以最低稀释倍数计算。若最低稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,或典型菌落数均小于15CFU,且无确证的肠杆菌科菌落,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。6.4.3特殊情况第一稀释度平板上的典型菌落数均大于150CFU,且有确证的肠杆菌科菌落,以及第二稀释度平板上无确证的肠杆菌科菌落或典型菌落数不在15CFU~150CFU之间,则以确证的菌落数乘以第一稀释倍数计算,示例见A.5。若所有稀释度的平板上典型菌落数均不在适宜计数范围内,且无确证的肠杆菌科菌落,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。7报告7.1菌落数小于100时,以整数报告。7.2菌落数大于或等于100时,对第3位数字进行修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,采用两位有效数字。7.3数字修约按“四舍五入”原则进行。GB4789.41—201657.4若所有平板上为蔓延菌落而无法计数,则报告菌落蔓延。7.5若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。7.6称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告。第二法肠杆菌科MPN计数法8检验程序肠杆菌科MPN计数法检验程序见图2。图2肠杆菌科MPN计数法检验程序GB4789.41—201669操作步骤9.1样品的稀释按6.1进行。9.2接种和培养9.2.1非选择性前增菌根据对样品污染状况的估计及相关限量要求,选择3个适宜连续稀释度的样品匀液,每个稀释度3管,共9管BPW于36℃±1℃培养18h±2h。9.2.2选择性增菌从BPW各培养管中,分别移取1mL培养物,接种于10mL的EE肉汤中,36℃±1℃培养24h±2h。9.2.3分离用接种环从EE各肉汤管中分别取培养物1环,划线接种于VRBGA平板,36℃±1℃培养24h±2h,观察平板上有无典型菌落。9.3典型菌落的确认典型菌落确认见6.3。10报告肠杆菌科为革兰氏阴性无芽胞杆菌,发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性。只要有1个菌落确认为肠杆菌科,其所代表的EE管即为肠杆菌科阳性,依据EE阳性管数查MPN表(见附录C),报告每克(毫升)样品中肠杆菌科的MPN值。称重取样以MPN/g为单位报告,体积取样以MPN/mL为单位报告。GB4789.41—20167附录A结果计算示例A.1两个连续稀释度均含适宜的典型菌落数平板,并含有已确证的肠杆菌科菌落,数据见表A.1。表A.1肠杆菌科平板计数结果示例1稀释度1∶100(第一稀释度)1∶1000(第二稀释度)典型菌落数/CFU1261452024用于确认试验的菌落数/CFU5555确证的菌落数/CFU4543a4/5×126=1015/5×145=1454/5×20=163/5×24=14N=101+145+16+14[2+(0.1×2)]×10-2=2760.022=12545上述数据按7.2数字修约后,表示为13000或1.3×104。A.2两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板,其中某一稀释度的一个平板菌落数不在适宜范围内,或者两个稀释度各有一个平板菌落数不在适宜范围内,则相应的平板不作为计数平板,数据见表A.2。表A.2肠杆菌科平板计数结果示例2稀释度1∶100(第一稀释度)1∶1000(第二稀释度)典型菌落数/CFU1261182010用于确认试验的菌落数/CFU585—确证的菌落数/CFU454—a4/5×126=1015/8×118=744/5×20=16—N=101+74+16[2+(0.1×1)]×10-2=1910.021=9095上述数据按7.2数字修约后,表示为9100或9.1×103。A.3两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板,其中一个平板无已确证的肠杆菌科菌落,则相应的平板不作为计数平板,数据见表A.3。表A.3肠杆菌科平板计数结果示例3稀释度1∶100(第一稀释度)1∶1000(第二稀释度)典型菌落数/CFU1261182020用于确认试验的菌落数/CFU5655确证的菌落数/CFU4640a4/5×126=1016/6×118=1184/5×20=160N=101+118+16+0[2+(0.1×1)]×10-2=2350.021=11190上述数据按7.2数字修约后,表示为11000或1.1×104。GB4789.41—20168A.4两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板,但无已确证的肠杆菌科菌落,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。A.5第一稀释度平板上的菌落数超过150CFU,且有证实的肠杆菌科菌落,以及第二稀释度平板上无确证的肠杆菌科菌落或典型菌落数不在15CFU~150CFU之间,则以确证的菌落数乘以第一稀释倍数计算,数据见表A.5。表A.5肠杆菌科平板计数结果示例5稀释度1∶100(第一稀释度)1∶1000(第二稀释度)典型菌落数/CFU2201982317用于确认试验的菌落数/CFU5555确证的菌落数/CFU4300a4/5×220=1763/5×198=11900N=176+1192æèçöø÷×102=14750GB4789.41—20169附录B培养基和试剂B.1缓冲蛋白胨水(BPW)B.1.1成分蛋白胨10.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠3.5g磷酸二氢钾1.5g蒸馏水1000.0mLB.1.2制法将B.1.1成分加热溶解,于25℃时调节pH至7.2±0.2,分装于500mL广口瓶中,每瓶225mL,121℃高压灭菌15min。B.2缓冲葡萄糖煌绿胆盐肉汤(EE肉汤)B.2.1成分蛋白胨10.0g葡萄糖5.0g磷酸氢二钠(无水)6.45g磷酸二氢钾2.0g牛胆盐20.0g煌绿0.0135g蒸馏水1000.0mLB.2.