GB 5009.210-2016 食品安全国家标准 食品中泛酸的测定

中华人民共和国国家标准GB5009.210—2016食品安全国家标准食品中泛酸的测定2016-08-31发布2017-03-01实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布GB5009.210—2016Ⅰ前言本标准代替GB/T5009.210—2008《食品中泛酸的测定》、GB5413.17—2010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中泛酸的测定》。本标准与GB/T5009.210—2008相比,主要变化如下:———标准名称修改为“食品安全国家标准食品中泛酸的测定”;———增加了高效液相色谱方法;———修改了食品的前处理方法;———增加了检出限和定量限。GB5009.210—20161食品安全国家标准食品中泛酸的测定1范围本标准规定了食品中泛酸和泛酸钙的测定方法。本标准第一法适用于食品中泛酸的测定,第二法适用于营养素补充剂类保健食品和配方食品中泛酸(钙)的测定。第一法微生物法2原理泛酸是植物乳杆菌Lactobacillusplantarum(ATCC8014)生长所必需的营养素,在一定控制条件下,将植物乳杆菌液接种至含有试样液的培养液中,培养一定时间后测定透光率(或吸光度值),根据泛酸含量与透光率(或吸光度值)的标准曲线计算出试样中泛酸的含量。3试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的二级水。3.1试剂3.1.1盐酸(HCl)。3.1.2冰乙酸(C2H4O2)。3.1.3氢氧化钠(NaOH)。3.1.4氯化钠(NaCl)。3.1.5碳酸钠(Na2CO3)。3.1.6碳酸氢钾(KHCO3)。3.1.7磷酸氢二钾(K2HPO4)。3.1.8三水合乙酸钠(C2H3O2Na·3H2O)。3.1.9三水合磷酸二氢钾(KH2PO4·3H2O)。3.1.10七水合硫酸镁(MgSO4·7H2O)。3.1.11七水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)。3.1.12一水合硫酸锰(MnSO4·H2O)。3.1.13三羟甲基氨基甲烷(C4H11NO3)。3.1.14葡萄糖(C6H12O6)。3.1.15甲苯(C7H8)。3.1.16无水乙醇(C2H6O)。3.1.17阴离子交换树脂Dowex1×8:粒度38μm~75μm。GB5009.210—201623.1.18碱性磷酸酶:酶活力≥23U/g。3.1.19鸽子肝脏丙酮提取物干粉(liveracetonepowder,frompigeon):酶活力≥0.1U/g。3.1.20蛋白胨:含氮量≥10%。3.1.21酵母提取物:含氮量≥10%。3.1.22琼脂。3.2试剂配制3.2.1乙酸溶液(0.2mol/L):吸取11.8mL冰乙酸,用水稀释至1000mL,混匀。3.2.2乙酸钠溶液(0.2mol/L):称取27.2g三水合乙酸钠,加水溶解并稀释至1000mL,混匀。3.2.3盐酸溶液(1mol/L):吸取83mL盐酸,加水稀释至1000mL,混匀。3.2.4盐酸浸泡液:吸取100mL盐酸与50倍水混合。3.2.5氢氧化钠溶液(1mol/L):称取40g氢氧化钠,加水溶解并稀释至1000mL,混匀。3.2.6氢氧化钠溶液(0.1mol/L):称取4g氢氧化钠,加水溶解并稀释至1000mL,混匀。3.2.7Tris缓冲液:称取121.0g三羟甲基氨基甲烷溶于500mL水中,用冰乙酸调pH至8.1±0.1,加水至1000mL,混匀。贮存于2℃~4℃冰箱中,可保存2周。3.2.8生理盐水:称取9g氯化钠,加水溶解并稀释至1000mL,混匀。临用前预先灭菌,于121℃高压灭菌10min后备用。3.2.9乙醇溶液(20%):量取200mL无水乙醇与800mL水混匀。3.2.10碳酸钠溶液(0.08mol/L):称取8.5g碳酸钠,加水溶解并稀释至1000mL,混匀。3.2.11碳酸氢钾溶液(0.02mol/L):称取2g碳酸氢钾,加水溶解并稀释至1000mL。混匀。3.2.12碱性磷酸酶溶液:称取2g碱性磷酸酶,加水溶解并稀释至100mL。临用现配,2℃~4℃冰箱预冷。3.2.13鸽子肝脏提取液3.2.13.1活化Dowex1×8:称取100gDowex1×8于锥形瓶中,加入1L盐酸溶液,置于振荡器上充分振摇10min,用铺有滤纸的布氏漏斗过滤。Dowex1×8转回锥形瓶,再加入1L盐酸溶液重复振摇、过滤。Dowex1×8加入1L水振摇10min,过滤,重复用水洗涤10次。逐滴加入Tris缓冲液调节Dowex1×8pH至8.0±0.1。2℃~4℃冰箱保存,2天内用完。3.2.13.2鸽子肝脏提取液:配制此试剂前一天将所用容器放入2℃~4℃冰箱中冷藏过夜。称取30g鸽子肝脏丙酮提取物干粉,放入研钵中,冰浴条件下分两次加入300mL碳酸氢钾溶液研磨至匀浆,转入具塞离心管中,盖好塞后充分振摇,-20℃冷冻10min后以3000r/min离心5min,将上清液转至500mL广口瓶中。加150g活化Dowex1×8,放入冰浴中混匀5min,将混合液倒入离心管中,3000r/min离心5min。将上清液移入另一500mL预冷的广口瓶中,-20℃冷冻10min,再加150g活化Dowex1×8,放入冰浴中混匀5min,将混合液倒入离心管中,3000r/min离心,将上清液分装于具塞试管中(每管大约3mL),-20℃冷冻保存。用前于2℃~4℃冰箱内化冻并保存至用时。3.3培养基3.3.1甲盐溶液:分别称取25g磷酸氢二钾和25g三水合磷酸二氢钾,加水溶解并稀释至500mL,混匀。加入1mL甲苯,2℃~4℃冰箱可保存1年。3.3.2乙盐溶液:分别称取10g七水合硫酸镁、0.5g氯化钠、0.5g七水合硫酸亚铁和0.5g一水合硫酸锰,加水溶解并稀释至500mL。加5滴盐酸,2℃~4℃冰箱可保存1年。3.3.3琼脂培养基:按表1称取或吸取各试剂,加水至100mL,混合,沸水浴加热至琼脂完全溶化。趁热用1mol/L盐酸溶液和/或1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.8±0.1。尽快分装,根据试管内径粗细加入3mL~5mL,液面高度不得低于2cm。塞上棉塞,121℃高压灭菌15min。取出后试管直立放GB5009.210—20163置,待冷却后于冰箱内保存,备用。表1菌种储备用琼脂培养基配制一览表试剂用量葡萄糖1.0g蛋白胨0.8g酵母提取物干粉0.2g三水合乙酸钠1.7g甲盐溶液0.2mL乙盐溶液0.2mL琼脂1.2g3.3.4泛酸测定用培养液:可按附录A配制泛酸测定用培养液。也可直接由试剂公司购买效力相当的泛酸测定用培养基,用前按说明书配制。3.4标准品D-泛酸钙(C18H32CaN2O10):纯度≥99%。3.5标准溶液的配制3.5.1泛酸标准储备溶液(40.0μg/mL):精确称取43.5mg预干燥至恒重的D-泛酸钙,加水溶解并转移至1000mL容量瓶中,加10mL乙酸溶液,100mL乙酸钠溶液,用水定容至刻度。储存于棕色瓶中,加入3滴~5滴甲苯,于2℃~4℃冰箱中可保存2年。3.5.2泛酸标准中间液(1.00μg/mL):准确吸取25.0mL泛酸标准储备溶液置于1000mL容量瓶中,加入10mL乙酸溶液,100mL乙酸钠溶液,用水定容至刻度。加入3滴~5滴甲苯于2℃~4℃冰箱中可保存1年。3.5.3泛酸标准工作溶液(20ng/mL):准确吸取2.00mL泛酸标准中间溶液置于100mL容量瓶中,用水定容至刻度,混匀。临用前现配。4仪器和设备4.1天平:感量0.1mg。4.2恒温培养箱:37℃±1℃。4.3压力蒸汽消毒器:121℃。4.4漩涡振荡器。4.5离心机:转速≥3000r/min。4.6接种针和接种环。4.7pH计:精度±0.01。4.8紫外-分光光度计。4.9超净工作台。4.10超声振荡器。GB5009.210—201645菌种的制备与保存5.1菌种植物乳杆菌Lactobacillusplantarum(ATCC8014)。5.2储备菌种的制备将菌种植物乳杆菌Lactobacillusplantarum(ATCC8014)转接至琼脂培养基中,在37℃±1℃恒温箱中培养20h~24h,连续传种2次~3次。取出后放入2℃~4℃冰箱作为储备菌株保存。每月至少传代一次,不宜超过25代。试验前将储备菌株接种至琼脂培养基中,37℃±1℃恒温培养箱中培养20h~24h以活化菌株,用于接种液的制备。注:保存数周以上的储备菌株,不能立即用作接种液制备,试验前宜连续传种2代~3代以保证细菌活力。5.3接种液的制备试验前一天,取2mL泛酸标准工作溶液和4mL泛酸测定用培养液混匀,分装于2支5mL离心管中,塞好棉塞,于121℃高压灭菌15min后即为种子培养液。冷却后用接种环将活化的菌株转种至2支种子培养液中,于37℃±1℃恒温培养箱中培养20h~24h。取出后3000r/min离心10min,弃上清液,无菌操作下用已预先灭菌的生理盐水淋洗2次,3000r/min离心10min,弃上清液。再加入3mL灭菌生理盐水,振荡混匀,制成接种液,立即使用。6分析步骤注:所有操作均需避光进行6.1试样制备谷薯类、豆类、乳粉等试样需粉碎、研磨、过筛(筛板孔径0.3mm~0.5mm);肉、蛋、坚果等用匀质器制成食糜;果蔬、半固体食品等试样需匀浆混匀;液体试样用前振摇混合。4℃冰箱可保存1周。6.2试样提取6.2.1直接提取法形态为颗粒、粉末、片剂、液体的营养素补充剂或强化剂、预混料,添加了泛酸钙的配方食品或保健食品可采用直接提取法。准确称取适量试样(m),固体试样0.2g~2g;液态试样5g~10g,精确至0.001g,转入100mL锥形瓶中,加入80mL乙醇溶液,具塞,超声振摇提取4h以上至试样完全溶解,用水定容至100mL(V1)。6.2.2酶解法一般谷薯类、肉蛋乳类、果蔬菌藻类、豆及坚果类等食品试样宜采用酶解提取法。6.2.2.1水解:准确称取适量试样(m,约含0.02mg~0.2mg泛酸),精确至0.001g。一般谷薯类、肉类、蛋类、豆类及其制品称取1g~5g;新鲜果蔬、乳及其制品称取5g~10g。转入至100mL锥形瓶中,加10mLTris缓冲液、40mL水,振荡混匀。于121℃高压条件下水解15min。冷却至室温,转移GB5009.210—20165至100mL容量瓶中,用水定容至刻度(V1),过滤。6.2.2.2酶解:准确吸取适量试样滤液(1.0mL~10.0mL,V2)至25mL具塞刻度试管底部,补水至10mL,加5mLTris缓冲液。在冰浴条件下,依次小心加入预冷的0.1mL碳酸氢钠溶液、0.4mL碱性磷酸酶溶液、0.2mL鸽子肝脏提取液和0.4mL水。小心混匀试管,避免混合物黏附于试管壁,加1滴甲苯,37℃±1℃温箱中温育过夜(8h以上)。加水至20mL,用冰乙酸调节pH至4.5±0.1,加水定容至25.0mL(V3),过滤。调节pH:吸取适量的试样酶解液(2.0mL~20.0mL,V4)于25mL具塞刻度试管中,加水至20mL,用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.8±0.1,用水定容至25.0mL(V5)。另取一试管加入5mLTris缓冲液和10mL水,同法加入碳酸氢钠溶液、碱性磷酸酶溶液、鸽子肝脏提取液酶液及温育过夜,并调节pH至6.8±0.1,用水定容至25.0mL作为酶空白液。注:以谷物、乳粉等为基质的配方食品如需计量基质本底泛酸含量,可采用酶解法提取。6.3稀释根据试样中泛酸含量用水对试样提取液进行适当稀释(F),使稀释后试样提取液中泛酸浓度约为20ng/mL。6.4测定系列管制备所用试管使用前洗刷干净,用水煮沸30min,沥干后放入盐酸浸泡液中浸泡2h,经170℃烘3h后使用。6.4.1试样和酶空白系列管取4支试管,分别加入1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL试样提取液(Vx),补水至5.0mL,加入5.0mL泛酸测定用培养液,混匀。另取4支试管分别加入1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL酶空白液。6.4.2标准系列管取试管分别加入泛酸标准工作溶液0