GB 5413.40-2016 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定

中华人民共和国国家标准GB5413.40—2016食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定2016-08-31发布2017-03-01实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布GB5413.40—20161食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定1范围本标准规定了液相色谱法测定游离核苷酸总量的方法。本标准适用于婴幼儿食品和乳品中游离核苷酸总量(包括胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、次黄嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、腺嘌呤核苷酸)的测定。2原理试样经过水提取,用沉淀剂沉淀蛋白质后,通过高效液相色谱分离,用紫外检测器外标法测定试样中核苷酸的含量。3试剂与材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的三级水,液相色谱流动相用水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂3.1.1淀粉酶:酶活力≥1.5U/mg。3.1.2冰乙酸(CH3COOH)。3.1.3四丁基硫酸氢铵[(C4H9)4NHSO4]。3.1.4甲醇(CH3OH)。3.1.5磷酸氢二钾(K2HPO4)。3.1.6磷酸二氢钾(KH2PO4)。3.1.7磷酸(H3PO4)。3.2试剂配制3.2.1乙酸溶液(100mL/L):吸取10mL冰乙酸,加水定容到100mL。3.2.2磷酸氢二钾溶液(0.1mol/L):称取2.28g磷酸氢二钾,用超纯水溶解并定容到100mL。3.2.3磷酸盐缓冲液(1.40mmol/L四丁基硫酸氢铵,0.01mol/L磷酸二氢钾):称取1.360g磷酸二氢钾,加0.4753g四丁基硫酸氢铵,加900mL水溶解,用磷酸氢二钾溶液调pH至3.2,用水定容到1000mL。一周内使用。3.3核苷酸标准品3.3.1胞嘧啶核苷酸(CMP)(C9H14N3O8P):纯度≥99%。3.3.2腺嘌呤核苷酸(AMP)(C10H14N5O7P):纯度≥99%。3.3.3尿嘧啶核苷酸(UMP)(C9H13N2O9P):纯度≥99%。GB5413.40—201623.3.4鸟嘌呤核苷酸(GMP)(C10H14N5O8P):纯度≥99%。3.3.5次黄嘌呤核苷酸(IMP)(C10H13N4O8P):纯度≥99%。3.4标准溶液配制核苷酸标准混合液(应当天配置):分别称取核苷酸标准品CMP、AMP、UMP各10mg、GMP和IMP各5mg(准确至0.1mg),用超纯水溶解转移至同一个100mL容量瓶中,用水定容至100mL。此标准溶液浓度为:CMP、AMP、UMP各100μg/mL;GMP、IMP各50μg/mL。每个组分称取的质量都要校正水分和钠盐含量,以酸型计。4仪器与设备4.1高效液相色谱仪:配有紫外检测器或二极管阵列检测器。4.2天平:感量0.1mg。4.3pH计:精度0.01。4.4恒温培养箱:±2℃。5分析步骤5.1试样制备5.1.1样品预处理5.1.1.1含淀粉的试样称取混合均匀的固体试样约5g(精确至0.1mg),于100mL锥形瓶中,加入约0.2g淀粉酶,加入20mL热水(30℃~40℃)充分溶解试样,或称取混合均匀的液体试样约20g(精确至1mg)于100mL锥形瓶中,加入约0.2g淀粉酶摇匀,于37℃±2℃培养箱内酶解30min。取出冷却至室温。5.1.1.2不含淀粉的试样称取混合均匀的固体试样约5g(精确至0.1mg),于100mL锥形瓶中,加入20mL热水(50℃~60℃)充分溶解试样,冷却至室温,或称取混合均匀的液体试样约20g(精确至1mg)于100mL锥形瓶中。5.1.2待测液的制备用醋酸溶液调试样溶液pH4.1,移入50mL容量瓶中,定容,滤纸过滤,所得滤液用0.45μm微膜过滤备用。5.2参考色谱条件5.2.1流动相:磷酸盐缓冲液+甲醇=1000+40。5.2.2色谱柱:C18-T反相色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)或具同等性能的色谱柱。5.2.3流速:1mL/min。5.2.4波长:254nm。5.2.5柱温:25℃。5.2.6进样体积:10μL。注:必要时可以用磷酸或磷酸氢二钾溶液适当调流动相的pH至分离情况最佳。GB5413.40—201635.3标准曲线绘制分别吸取标准混合溶液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL,加超纯水定容至50mL,配成核苷酸系列标准工作液,见表1。表1核苷酸系列标准工作液各组分浓度单位为微克每毫升序号CMPAMPUMPGMPIMP14442228884431212126641616168852020201010将上核苷酸系列标准工作液分别注入高效液相色谱仪中,测定相应的峰面积或峰高。以峰面积或峰高为纵坐标,以标准测定液浓度为横坐标绘制标准曲线。5.4试样溶液的测定将制备好的试样溶液注入高效液相色谱仪中,测定相应的峰面积或峰高。根据标准曲线得到待测液中核苷酸的浓度(μg/mL)。6分析结果的表述6.1结果计算试样中游离核苷酸各组分的含量Xi(CMP、UMP、GMP、IMP、AMP)按式(1)计算:Xi=Ci×Vi×nmi×1000×100……………………(1)式中:Xi———试样中核苷酸各组分的含量(分别是:XCMP、XUMP、XGMP、XIMP、XAMP),单位为毫克每百克(mg/100g);Ci———试样溶液中核苷酸各组分的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);Vi———试样溶液的体积,单位为毫升(mL);n———样液稀释倍数;mi———试样的质量,单位为克(g)。试样中游离核苷酸的总量按式(2)计算:X总=ΣXi=XCMP+XAMP+XUMP+XGMP+XIMP……………………(2)式中:X总———试样中游离核苷酸的总量,单位为毫克每百克(mg/100g);XCMP———按式(1)计算出的游离胞嘧啶核苷酸含量,单位为毫克每百克(mg/100g);XAMP———按式(1)计算出的游离腺嘌呤核苷酸含量,单位为毫克每百克(mg/100g);XUMP———按式(1)计算出的游离尿嘧啶核苷酸含量,单位为毫克每百克(mg/100g);XGMP———按式(1)计算出的游离鸟嘌呤核苷酸含量,单位为毫克每百克(mg/100g);XIMP———按式(1)计算出的游离次黄嘌呤核苷酸含量,单位为毫克每百克(mg/100g)。GB5413.40—201646.2结果表示计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留到小数点后两位。7精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。8其他高效液相色谱紫外法标准和试样核苷酸色谱图见附录A。本标核苷酸各组分定量限分别为:CMP定量限为3.3mg/kg。AMP定量限为5.0mg/kg。UMP定量限为5.0mg/kg。GMP定量限为5.0mg/kg。IMP定量限为6.7mg/kg。GB5413.40—20165附录A核苷酸标准品和试样高效液相色谱图A.1核苷酸标准品色谱图核苷酸标准品色谱图见图A.1。图A.1核苷酸标准品色谱图A.2样品色谱图样品色谱图见图A.2。图A.2样品色谱图