SNT 3730.8-2013 食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第8部分：猪成分检测 实时荧光P

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜３７３０．８—２０１３食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法　第８部分：猪成分检测实时荧光犘犆犚法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犱狅犿犲狊狋犻犮犪狀犻犿犪犾犻狀犵狉犲犱犻犲狀狋犻狀犳狅狅犱犪狀犱犳犲犲犱—犘犪狉狋８：犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狆犻犵犻狀犵狉犲犱犻犲狀狋—犚犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚犿犲狋犺狅犱２０１３１１０６发布２０１４０６０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　ＳＮ／Ｔ３７３０《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法》共分为以下８个部分：———第１部分：貂成分检测　实时荧光ＰＣＲ法；———第２部分：狗成分检测　实时荧光ＰＣＲ法；———第３部分：狐狸成分检测　实时荧光ＰＣＲ法；———第４部分：驴成分检测　实时荧光ＰＣＲ法；———第５部分：马成分检测　实时荧光ＰＣＲ法；———第６部分：猫成分检测　实时荧光ＰＣＲ法；———第７部分：水牛成分检测　实时荧光ＰＣＲ法；———第８部分：猪成分检测　实时荧光ＰＣＲ法。本部分为ＳＮ／Ｔ３７３０的第８部分。本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本部分主要起草人：高宏伟、林超、孙敏、刘彩霞、陈颖、吴亚君、韩建勋、黄文胜、邓婷婷。Ⅰ犛犖／犜３７３０．８—２０１３食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法　第８部分：猪成分检测实时荧光犘犆犚法１　范围ＳＮ／Ｔ３７３０的本部分规定了畜肉食品中猪成分检测方法。本部分适用于食品及饲料中猪组织成分的定性检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ／Ｔ２７４０３　实验室质量控制规范　食品分子生物学检测３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１　猪　犛狌狊偶蹄目，猪形亚目猪科，猪属动物。３．２　实时荧光犘犆犚　狉犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚在ＰＣＲ反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个ＰＣＲ扩增过程。３．３　犆狋值　犮狔犮犾犲狋犺狉犲狊犺狅犾犱每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。４　缩略语下列缩略语适用于本文件。ＤＮＡ：脱氧核糖核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｌｅｉｃａｃｉｄ）ｄＮＴＰ：脱氧核苷酸三磷酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ＣＴＡＢ：十六烷基三甲基溴化铵（ｃｅｔｙｌｔｒｉｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）Ｔｒｉｓ：三（羟甲基）氨基甲烷（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）ＥＤＴＡ：乙二胺四乙酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）犜犪狇：水生栖热菌（犜犺犲狉犿狌狊犪狇狌犪狋犻犮狌）ＯＤ：光密度值（ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ）１犛犖／犜３７３０．８—２０１３５　方法提要样品经研磨后，提取ＤＮＡ，以ＤＮＡ为模板，采用猪线粒体ａｔｐ８基因特异性检测引物和探针进行实时荧光ＰＣＲ扩增，根据Ｃｔ值，判断样品中是否存在猪成分。６　试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格。所有试剂均用无ＤＮＡ酶污染的容器分装。６．１　检测用引物（对）序列和探针：猪成分扩增引物和探针、内参照（真核生物成分）引物和探针详见表１。表１　试验用引物和探针名称序列（５’３’）目的基因内参照５’端引物内参照３’端引物内参照探针Ｆ：５ＴＣＴＧＣＣＣＴＡＴＣＡＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡ３Ｒ：５ＡＡＴＴＴＧＣＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴ３Ｐ：５ＦＡＭＣＣＧＴＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＧＧＡＡＴＣＧＡＡＣＣＴＡＭＲＡ３真核生物１８ＳｒＲＮＡ基因猪成分５’端引物猪成分３’端引物猪成分探针Ｆ：ＡＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＣＡＴＴＡＣＡＡＴＴＡＣ３Ｒ：ＣＴＡＴＧＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＴＴＧＡＧＴＴＣＡ３Ｐ：５ＦＡＭＡＴＣＴＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＴＡＣＣＣＡＴＡＭＡＲＡ３猪线粒体ａｔｐ８基因６．２　ＣＴＡＢ缓冲液：５５ｍｍｏｌ／ＬＣＴＡＢ，１４００ｍｍｏＩ／ＬＮａＣｌ，２０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ，用１０％盐酸调ｐＨ至８．０，１２１℃，高压灭菌２０ｍｉｎ，备用。６．３　ＴＥ缓冲液（ＴｒｉｓＣｌ、ＥＤＴＡ缓冲液）：１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）。６．４　蛋白酶Ｋ：２０ｍｇ／μＬ。６．５　ＲＮＡ酶溶液：５μｇ／μＬ。６．６　Ｔｒｉｓ饱和酚。６．７　三氯甲烷。６．８　异戊醇。６．９　异丙醇。６．１０　７０％乙醇。６．１１　犜犪狇ＤＮＡ聚合酶。６．１２　ｄＮＴＰ混合液。６．１３　１０×ＰＣＲ缓冲液：２００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．４），２００ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ，１５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２。７　仪器和设备７．１　实时荧光ＰＣＲ仪。７．２　离心机：最大离心力≥１６０００犵。７．３　微量移液器：１μＬ～１０μＬ、５μＬ～１００μＬ、５μＬ～２００μＬ、２０μＬ～１０００μＬ。７．４　冰箱：２℃～８℃，－２０℃。２犛犖／犜３７３０．８—２０１３７．５　高压灭菌器。７．６　核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。７．７　ｐＨ计。７．８　天平：感量０．０１ｇ。７．９　水浴锅。７．１０　涡旋振荡器。８　检测步骤８．１　犇犖犃提取８．１．１　称取０．３ｇ已制备好的样品于２ｍＬ离心管中，加入１０００μＬＣＴＡＢ缓冲液和４０μＬ蛋白酶Ｋ，振荡混匀，６５℃３０ｍｉｎ，期间每隔１０ｍｉｎ振荡混匀。８．１．２　１２０００犵离心１０ｍｉｎ，转移１ｍＬ上清液至２ｍＬ离心管中。８．１．３　加入５００μＬ酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液，体积比为２５∶２４∶１；强烈振荡，１２０００犵离心１５ｍｉｎ。８．１．４　吸取上清液至一新离心管中，加入等体积异丙醇，振荡均匀，１２０００犵离心１０ｍｉｎ。８．１．５　弃去上清液，用预热至６５℃的ＴＥ缓冲液溶解ＤＮＡ。８．１．６　加入５μＬＲＮＡ酶溶液，３７℃３０ｍｉｎ。８．１．７　加入２００μＬ三氯甲烷异戊醇（２４∶１），强烈振荡，１２０００犵离心１５ｍｉｎ。８．１．８　吸取上清液至一新离心管中，加入等体积异丙醇，振荡均匀，１２０００犵离心１０ｍｉｎ。８．１．９　弃去上清液，７０％乙醇洗涤一次，１２０００犵离心１ｍｉｎ。８．１．１０　弃上清液，晾干；加入５０μＬＴＥ缓冲液，溶解ＤＮＡ沉淀。８．１．１１　同一天内使用的ＤＮＡ在４℃保存，２天后使用的ＤＮＡ保存与－２０℃。长期保存的ＤＮＡ保存在－８０℃。８．２　犇犖犃浓度和纯度的测定取适量ＤＮＡ溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测２６０ｎｍ和２８０ｎｍ处的吸收值。ＤＮＡ的浓度按照式（１）计算。当浓度为１０μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬ，犃２６０／犃２８０比值在１．７～１．９之间时，适宜于实时荧光ＰＣＲ扩增。犮＝犃２６０×犖×５０…………………………（１）　　式中：犮　———ＤＮＡ浓度，单位为微克每毫升（μｇ／ｍＬ）；犃２６０———２６０ｎｍ处的吸光值；犖———核酸稀释倍数。８．３　实时荧光犘犆犚检测８．３．１　实时荧光犘犆犚反应体系反应体系总体积为２５μＬ，其中含：样品ＤＮＡ（１０μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬ）２μＬ，猪引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各１μＬ，猪探针（５μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，犜犪狇ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μＬ）０．５μＬ，ｄＮＴＰ（１０μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，１０×ＰＣＲ缓冲液２．５μＬ，水１６μＬ。也可采用商品化的实时荧光ＰＣＲ扩增体系，样品ＤＮＡ２μＬ，猪引物对各１μＬ，猪探针１μＬ，ｄＮＴＰ１μＬ，犜犪狇酶０．５μＬ，水补足至总体积２５μＬ。真核生物内参照的反应体系同上，仅以真核生物引物对和探针替换猪引物对和探针。３犛犖／犜３７３０．８—２０１３８．３．２　实时荧光犘犆犚反应参数５０℃／２ｍｉｎ，９５℃／１０ｍｉｎ；４５个循环为９５℃／１５ｓ，５８℃／１ｍｉｎ。８．３．３　实验对照检验过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以猪提取的ＤＮＡ为阳性对照，以已知不含有猪成分的样品提取的ＤＮＡ为阴性对照，以灭菌水为空白对照。样品、内参照和对照设置两个平行的反应体系。９　质量控制以下条件有一条不满足时，实验视为无效：ａ）　空白对照：无荧光对数增长，相应的Ｃｔ值＞４０．０；ｂ）　阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ｃｔ值＞４０．０；ｃ）　阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ｃｔ值＜３０．０；ｄ）　内参照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ｃｔ值＜３０．０。１０　结果判定及表述１０．１　结果判定在符合第９章的情况下，被检样品进行检测时：ａ）　如Ｃｔ值≤３５．０，则判定为被检样品阳性，扩增靶标序列参见附录Ａ；ｂ）　如Ｃｔ值≥４０．０，则判定为被检样品阴性；ｃ）　如３５．０＜Ｃｔ值＜４０．０，则重复一次。如再次扩增后Ｃｔ值仍为＜４０．０，则判定被检样品阳性；如再次扩增后Ｃｔ值≥４０．０，则判定被检样品阴性。注：如有进一步确认要求，可对ＰＣＲ产物进行测序，ＰＣＲ产物序列参见附录Ａ。１０．２　结果表述１０．２．１　结果为阳性者，表述为“检出猪成分”。１０．２．２　结果为阴性者，表述为“未检出猪成分”。１１　防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照ＧＢ／Ｔ２７４０３中的规定执行。１２　方法检出限本方法所规定方法的最低检出限（ＬＯＤ）为１０ｍｇ／ｋｇ。４犛犖／犜３７３０．８—２０１３附　录　犃（资料性附录）猪成分的基因扩增靶标参考序列　　ＡＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＣＡＴＴＡＣＡＡＴＴＡＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＴＡＴＡＡＣＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＣＣＡＡＣＴＡＡＡＡＡＴＣＴＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＴＡＣＣＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＡＴＣＡＡＣＣＧＡＡＣＴＣＡＡＡＡＣＴＣＡＡＡＡＡＣＡＴＡＧ５犛犖／犜３７３０．８—２０１３书书书３１０２—８０３７３犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法　第８部分：猪成分检测实时荧光犘犆犚法ＳＮ／Ｔ３７３０．８—２０１３中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲２号（１０００１３）北京市西城区三里河北街１６号（１０００４５）总编室：[phone]网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张０．７５　字数１２千字２０１４年３月第一版　２０１４年３月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２６８２２　定价１６．００元