SZDBZ 267-2017 肉食品中鸡源性成分实时荧光 PCR检测方法

ICS67.120X22SZDB/Z深圳市标准化指导性技术文件SZDB/Z267—2017肉食品中鸡源性成分实时荧光PCR检测方法Real-timePCRfordetectionofchicken-derivedingredientsinfood2017-09-12发布2017-10-01实施深圳市市场监督管理局发布SZDB/Z267—2017I目次目次.................................................................................I 前言................................................................................II 1范围...............................................................................1 2规范性引用文件.....................................................................1 3术语和定义.........................................................................1 4缩略语.............................................................................1 5原理...............................................................................1 6设备...............................................................................2 7主要器械和设备.....................................................................2 8检验步骤...........................................................................2 9质量控制...........................................................................3 10结果判定与表述....................................................................3 附录A............................................................................4 SZDB/Z267—2017II前言本文件按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本文件的附录A为资料性附录。本文件由深圳市检验检疫科学研究院提出。本文件由中华人民共和国深圳出入境检验检疫局归口。本文件主要起草单位：深圳市检验检疫科学研究、深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心、深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心。本文件主要起草人：张彩虹、阮周曦、叶奕优、花群义、谢丽琪、林燕奎、林彦星、曹琛福、黄超华、孙洁、杨俊兴、吕建强、曾少灵。SZDB/Z267—20171肉食品中鸡源性成分实时荧光PCR检测方法1范围本文件规定了肉食品中鸡源性成分实时荧光PCR检测方法。本文件适用于肉食品中鸡源性成分的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法场地通用规范GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实时荧光PCRrealtimePCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。3.2Ct值cyclethreshold每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4缩略语COX3：细胞色素C氧化酶Ⅲ（cytochromecoxidasesubunitⅢ）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）ROX：6-羧基-X-罗丹明（6-Carboxyl-X-Rhodamine）CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide）Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）5原理SZDB/Z267—20172样品经研磨混匀后，提取DNA，以DNA为模板，采用鸡线粒体COX3基因特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增，根据Ct值，判断样品中是否存在鸡源性成分。6设备6.1试剂裂解液（参见附录A），三氯甲烷，异丙醇，75%乙醇，双蒸水。除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水为GB/T6682规定的二级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器盛装。6.2引物及探针序列a)上游引物F：5'-TCTCACTTACACTACTTGCCACATCTT-3'a)下游引物R：5'-CGTGTGTGTCCTGTTTGGACTAG-3'b)探针序列P：5’-FAM-CACTGCAACCTACAGCCTCCGCATAAC–BHQ1-3’7主要器械和设备高速离心机（最大离心力达12000g以上），微量移液器（10L,100L,1000L），实时荧光PCR仪，恒温水浴锅，天平（感量0.001g和0.1g），涡旋振荡器，pH计。8检验步骤8.1样品制备称取待检样品200mg，研磨混匀待用。8.2核酸提取称取上述混匀样品50mg于1.5mL离心管中，加入600L～800L裂解液，65℃作用30min，期间不时振荡混匀；12000r/min离心5min；转移上清液于洁净离心管中，加400L三氯甲烷/异戊醇（24:1），混匀；12000r/min离心5min，取上清液；加0.8倍体积预冷的异丙醇，沉淀；12000r/min离心5min，弃上清液；75%乙醇洗涤一次，晾干；加入50L双蒸水溶解沉淀，制成DNA溶液，保存-20℃待用。也可用等效DNA提取试剂盒提取样品DNA。8.3实时荧光PCR扩增反应体系：体积为20L，包括2×ProbeqPCRMIX10L（内含DNA聚合酶、dNTP等）、50×ROXReferencedye0.04L、正向引物(10mol/L)1L、反向引物(10mol/L)1L、探针(10mol/L)0.5L、模板DNA0.8L、补足双蒸水至总体积20L。也可选用其它商品化实时荧光PCR反应预混液。反应条件：95℃预变性20s；95℃变性3s，60℃退火30s，60℃收集荧光，40个循环。也可选用其它商品化实时荧光PCR反应预混液，并参照其说明书进行适当调整。8.4实验对照检测过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照，样品及对照均设两个重复，Ct值取两个重复的平均值作为最终结果。采用已知含有鸡源性成分的鸡肉提取的DNA作为阳性对照。采用已知不含鸡源性SZDB/Z267—20173成分的其它动物组织（如羊肉、鸭肉）提取的DNA作为阴性对照。采用与模板等体积的双蒸水作为空白对照。9质量控制9.1质控要求同时满足以下条件时，实验有效：a)空白对照：无荧光对数增长，无Ct值。b)阴性对照：无荧光对数增长，无Ct值。c)阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0。9.2防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的规定执行。10结果判定与表述10.1结果判定在符合9.1条的情况下，被检样品进行检测时：a)如Ct值≤35.0，且荧光通道出现典型的扩增曲线，则判定为被检样品阳性。b)如无Ct值，则判定为被检样品阴性。c)如35.0＜Ct值＜40.0，则重复一次。如再次扩增后Ct值＜40.0，则判定为被检样品阳性；如再次扩增后无Ct值，则判定被检样品阴性。10.2结果表述结果为阳性者，表述为“检出鸡源性成分”；结果为阴性者，表述为“未检出鸡源性成分”。SZDB/Z267—20174附录A(规范性附录)裂解液配制方法1%CTAB；0.05mol/LTris-HCl（pH8.0）；0.7mol/LNaCl；0.01mol/LEDTA(pH8.0)。