TTDSTIA 006-2019 奶及奶制品中乳铁蛋白的测定 液相色谱法

天津市奶业科技创新协会发布TB团体标准T/TDSTIA006—2019奶及奶制品中乳铁蛋白的测定液相色谱法Determinationoflactoferrininmilkanddairyproducts-Liquidchromatographymethod2019-11-26发布2019-12-01实施全国团体标准信息平台T/TDSTIA006-20191前言本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家奶业科技创新联盟提出，适用于联盟内部实施优质乳工程的企业，其他单位可参考。本标准起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室（北京），农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京）。本标准主要起草人：郑楠，李鹏，张养东，王加启，钟建萍，叶巧燕。全国团体标准信息平台T/TDSTIA006-20192奶及奶制品中乳铁蛋白的测定液相色谱法1范围本标准规定了奶及奶制品中乳铁蛋白的液相色谱测定方法。本标准适用于生乳、液态奶和乳粉。本标准生乳、液态奶的定量限为5.0mg/kg；乳粉的定量限为10.0mg/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理试样中的乳铁蛋白经磷酸盐缓冲液提取，肝素亲和柱富集净化，用液相色谱仪分析，经反相蛋白质分离柱分离，紫外光检测，外标法定量。4试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水。4.1氢氧化钠溶液（10mol/L）：称取400.00g氢氧化钠，加水溶解，定容至1L。4.2三氟乙酸溶液：量取1mL三氟乙酸（色谱纯），用水定容至1L，混匀。4.3三氟乙酸乙腈溶液：量取1mL三氟乙酸（色谱纯），用乙腈（色谱纯）定容至1L，混匀。4.4磷酸盐缓冲液Ⅰ：称取磷酸氢二钠23.85g，磷酸二氢钠4.99g，加适量水溶解，用氢氧化钠溶液（4.1）调节pH至7.50，定容至1L，混匀。4.5磷酸盐缓冲液Ⅱ：称取磷酸氢二钠5.96g，磷酸二氢钠0.96g，氯化钠5.84g，加适量水溶解，用氢氧化钠溶液（4.1）调节pH至7.50，定容至1L，混匀。4.6磷酸盐缓冲液Ⅲ：称取磷酸氢二钠5.96g，磷酸二氢钠2.50g，氯化钠119.30g，加适量水溶解，用氢氧化钠溶液（4.1）调节pH至7.50，定容至1L，混匀。4.7乳铁蛋白对照品：CAS：112163-33-4，纯度≥85.0%。4.8乳铁蛋白标准储备溶液（10mg/mL）：将乳铁蛋白对照品按对照品证书提供的纯度换算后称量，用水定容至10mL。于-20ºC保存，有效期4个月。4.9乳铁蛋白标准中间溶液（200mg/L）：准确移取乳铁蛋白标准储备溶液（4.8）200μL，用水定容至10mL。现用现配。4.10乳铁蛋白标准系列溶液：准确移取一定量的标准中间溶液（4.9），用磷酸盐缓冲液Ⅲ（4.6）稀释定容，配制成乳铁蛋白浓度分别为0.0mg/L、20.0mg/L、40.0mg/L、60.0mg/L、80.0mg/L和100.0mg/L的标准工作溶液，现用现配。全国团体标准信息平台T/TDSTIA006-201934.11肝素亲和柱：HiTrapHeparinHP柱，1mL；或其他性能类似的净化柱。4.12微孔滤膜：水系，0.22μm。5仪器设备5.1高效液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器。5.2天平：感量0.01g、0.1mg。5.3容量瓶：5mL、10mL、50mL、1000mL。5.4旋涡混合器。5.5离心机：转速不低于10000r/min。5.6固相萃取装置。5.7pH计：精度为0.01。6样品制备6.1生乳、液态奶：取有代表性样品约200g，混匀，装入洁净容器作为试样，密封并做好标识，于0ºC~4ºC冰箱内保存。6.2乳粉：取有代表性样品约200g，混匀，装入洁净容器作为试样，密封并做好标识，于常温下干燥保存。7试验步骤7.1提取7.1.1生乳、液态奶称取试样10g（精确到0.01g），加入磷酸盐缓冲液Ⅰ（4.4）定容至50mL，混匀，离心15min，吸取25mL中间层试液于另一50mL离心管中，离心15min。吸取上清液，待净化。7.1.2乳粉称取试样5g（精确到0.01g），加入磷酸盐缓冲液Ⅰ（4.4）混匀，定容至50mL，混匀，离心15min，吸取25mL中间层试液于另一50mL离心管中，离心15min。吸取上清液，待净化。7.2净化肝素亲和柱用10mL磷酸盐缓冲液Ⅱ（4.5）活化，准确移取10mL上清液（7.1）过柱，用10mL磷酸盐缓冲液Ⅱ（4.5）淋洗，用4.5mL磷酸盐缓冲液Ⅲ（4.6）洗脱，收集洗脱液，用磷酸盐缓冲液Ⅲ（4.6）定容至5.0mL，涡旋混匀，过微孔滤膜后待测。7.3测定步骤7.3.1液相色谱参考条件色谱柱：XbridgeProteinBEHC4柱（柱长250mm，柱内径4.6mm，填料粒径3.5m），或相当者。流动相：A：三氟乙酸溶液（4.2），B：三氟乙酸乙腈溶液（4.3）。检测波长：280nm。全国团体标准信息平台T/TDSTIA006-20194梯度洗脱条件见表1。流速：1.5mL/min。柱温：60ºC。进样量：30L。表1流动相梯度洗脱条件时间/（min）A/（%）B/（%）09556.5623810623812406015406015.595520.09557.3.2测定取标准系列溶液（4.10）和试样溶液（7.2）上机测定。以乳铁蛋白峰面积为纵坐标，以标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程。乳铁蛋白标准溶液的液相色谱图参见附录A。8试验数据处理试样中乳铁蛋白的质量分数X计，数值以毫克每千克(mg/kg)表示，按下列公式计算：10001000213VmVVcX式中：c—被测组分曲线计算浓度，单位为毫克每升(mg/L)；V3—样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；V1—试样处理液总体积，单位为毫升(mL)；m—试样质量，单位为克(g)；V2—样液过柱体积，单位为毫升(mL)；1000—换算系数。计算结果保留三位有效数字。9精密度在重现性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于算术平均值的15%。全国团体标准信息平台T/TDSTIA006-20195附录A（资料性附录）乳铁蛋白高效液相色谱图图A乳铁蛋白溶液（100mg/L）高效液相色谱图_________________________全国团体标准信息平台