DB37T 3572-2019 牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）检测技术规程

ICS65.020.01B40DB37山东省地方标准DB37/T3572—2019牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）检测技术规程CodeofpracticefordetectionofA2typeofβ-casein(A2milk)incow'smilk2019-05-29发布2019-06-29实施山东省市场监督管理局发布DB37/T3572—2019I目次前言................................................................................II1范围...............................................................................12规范性引用文件.....................................................................13术语和定义.........................................................................14检测原理...........................................................................15主要试剂配制.......................................................................26主要仪器设备.......................................................................27质谱检测及数据处理参数.............................................................28检测方法...........................................................................28.1样本采集.......................................................................28.2蛋白提取.......................................................................28.3蛋白质的消化...................................................................28.4质谱鉴定.......................................................................39结果判定...........................................................................39.1SDS-PAGE鉴定...................................................................39.2A2型β-酪蛋白的判定............................................................310废弃物的处理......................................................................311检测过程中防止交叉污染的措施......................................................3附录A（资料性附录）主要试剂配制................................................4附录B（资料性附录）主要仪器设备................................................6附录C（资料性附录）蛋白检测参数及结果..........................................8DB37/T3572—2019II前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东奥克斯畜牧种业有限公司、山东省畜牧总站、大同市南郊区四方高科农牧有限公司、中国农业大学、江苏省农业学院畜牧研究所。本标准主要起草人：黄金明、王秀革、鞠志花、姜强、王玲玲、张思聪、张亚冉、魏晓超、高亚平、刘文浩、高运东、侯明海、杨国瑞、戴蕴平、仲跻峰。DB37/T3572—20191牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）检测技术规程1范围本标准规定了牛奶和奶粉中A2型β-酪蛋白（A2奶）的检测方法。本标准适用于牛奶和奶粉中A2型β-酪蛋白（A2奶）的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB/T19495.2—2004转基因产品检测实验室技术要求GB/Z35959—2018液相色谱-质谱联用分析方法通则3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1A2型β-酪蛋白A2β-casein；A2CSN2β-酪蛋白由224个氨基酸（含有15个氨基酸的信号肽）组成，具有不同的变体型（A1、A2、A3、B、C、E、F、H1、I），当第51位、52位、82位、103位、108位、121位、137位、167位氨基酸分别为谷氨酸、谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸时，称为A2型β酪蛋白。3.2A2奶A2milk所含β酪蛋白为A2型的牛奶称为A2奶。3.3质谱法Massspectrometry；MS试样被电离后，形成不同质荷比的离子，根据这些离子的质量数和相对丰度分析试样的方法。3.4质荷比Mass-to-chargeratio离子的质量m与其所带的电荷数z之比，以m/z表示。4检测原理DB37/T3572—20192β-酪蛋白变体型对应不同的氨基酸突变位点（p.51E＞K、p.52E＞K、p.82P＞H、p.103L＞I、p.108M＞L、p.121H＞Q、p.137S＞R、p.167P＞L）（参考序列：GenBankAAA30431.1），而不同氨基酸之间存在分子量差异。利用质谱分析技术，根据质荷比差异将样品蛋白质中存在氨基酸突变的肽段鉴定出来，从而确定氨基酸突变位点，实现对不同变体型β-酪蛋白检测的目的。5主要试剂配制实验所用水为符合GB/T6682规定的双蒸水；高压灭菌条件为121℃，1.034×105Pa压力，蒸汽灭菌20min。试剂配制见附录A。6主要仪器设备见附录B。7质谱检测及数据处理参数见附录C。8检测方法8.1样本采集8.1.1待检测的新鲜牛奶每头奶牛采集新鲜牛奶（排除头奶或末乳）50mL，充分混匀后，-80℃保存。8.1.2待检测的商品化奶粉包装未开封，常温储存。8.2蛋白提取8.2.1从-80℃取出牛奶样本，常温解冻后充分混匀，取样50μL，或称取奶粉样本30mg。8.2.2向上述样品中加入500μL裂解液【8M尿素，30mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）】。冰上裂解10min。离心，4℃，20000g，30min。取上清，避免吸到油脂。8.2.3加入二硫苏糖醇（DTT）至终浓度10mM。56℃水浴1h。取出后，迅速加入碘乙酰胺（IAM）至终浓度55mM，暗室静置1h。8.2.4使用考马斯蓝染色法（bradford法）对蛋白质进行定量。8.2.5对定量后的蛋白质进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定（如附录C.1）。8.3蛋白质的消化8.3.1每个样品取20μg蛋白，加入到10K超滤管中，14000g，4℃，离心40min，弃废液。8.3.2加入200μL的25mM碳酸氢铵（NH4HCO3），14000g，4℃，离心40min，弃废液。8.3.3重复上述步骤两遍。8.3.4加入1μg/μL的胰蛋白酶（Trypsin）和V8蛋白酶（Glu-C）各1μL，37℃水浴24h。离心收集消化后的肽段。DB37/T3572—201938.3.5真空抽干消化后的肽段。8.3.60.1%甲酸（FA）复溶肽段。8.4质谱鉴定8.4.1将肽段上机检测。使用Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱质谱仪检测肽段信号，液相及质谱检测参数详见附录C表C.1、表C.2、表C.3。8.4.2质谱扫描完毕，得到质谱原始文件。将质谱原始文件输入到PD（ProteomeDiscoverer1.3,Thermo）软件后，筛选质谱谱图。筛选参数见附录C表C.4。8.4.3PD提取后的谱图用Mascot软件进行搜索，搜索结束后，PD软件根据Mascot软件搜索结果输出鉴定结果。检索参数见附录C表C.5，鉴定的肽段见附录C表C.6。9结果判定9.1SDS-PAGE鉴定将从样品中提取的蛋白质进行SDS-PAGE分离鉴定，检测蛋白条带是否清晰无降解。条带清晰，表示可用于后续检测，否则重新取样鉴定。见附录C.1。9.2A2型β-酪蛋白的判定根据质谱鉴定结果，当待测样品的8个氨基酸突变位点分别为p.51E、p.52E、p.82P、p.103L、p.108M、p.121H、p.137S、p.167P时，检测结果表述为“A2奶”（如图1）。下划线标出的氨基酸为不同变体型β-酪蛋白中存在突变的位点，实线框内为氨基酸突变类型图1A2型β-酪蛋白对应的氨基酸序列10废弃物的处理按照GB/T19495.2—2004的规定执行。11检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2—2004的规定执行。DB37/T3572—20194AA附录A（资料性附录）主要试剂配制A.1样品裂解液将480.4g尿素，7.1gHEPES溶于800mL蒸馏水中，充分溶解后，定容至1L。A.210%SDS将10g的SDS粉末溶于80mL蒸馏水中，充分溶解后，定容至100mL。A.330%丙烯酰胺将29g丙烯酰胺和1gN,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60mL的蒸馏水中，充分溶解后，定容至100mL。A.41.5MTris-HCl(pH8.8)将181.65gTris溶于800mL蒸馏水中，加浓盐酸调pH至8.8，定容至1000mL。A.51MTris-HCl(pH=6.8)将121.1gTris溶于800mL蒸馏水中，加浓盐酸调pH至6.8，定容至1000mL。A.610%过硫酸铵将10g过硫酸铵粉末溶于80mL蒸馏水中，充分溶解后，定容至100mL。A.7考马斯亮蓝染色液准确量取甲醇45mL，蒸馏水45mL，冰乙酸10mL，加入0.25g考马斯亮蓝R-250。A.8考染脱色液50mM碳酸氢铵/乙腈=1:1。A.91μg/μL胰蛋白酶将100μg胰蛋白酶溶解到100μL50mM乙酸中，-70℃储存。DB37/T3572—20195A.1025mM碳酸氢铵将2.0g碳酸氢铵溶于800mL蒸馏水中，充分溶解后，定容至1L。DB37/T3572—20196BB附录B（资料性附录）主要仪器设备B.1单道可调移液器2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL。B.2离心机最高转速12000r/min，最大容量24×1.5mL。B.3电子天平量程0.001～100g，感量0.001g。B.4凝胶成像分析系统有效像素1280×1024，检测灵敏度DNA≥0.05ng。B.5稳压稳流电泳仪输出电压0～600V，输出电流0～100mA。B.6垂直电泳槽外形尺寸15cm×12cm×13cm，凝胶板面积10cm×10cm。B.7高