DB37T 3624-2019 牛场气溶胶结核分枝杆菌复合群荧光定量PCR 检测技术规程

ICS11.220B41DB37山东省地方标准DB37/T3624—2019牛场气溶胶结核分枝杆菌复合群荧光定量PCR检测技术规程DetectionofMycobacteriumtuberculosiscomplexpathogenicorganismsinaerosolofcattlefarmbyReal-timePCR2019-07-23发布2019-08-23实施山东省市场监督管理局发布DB37/T3624—2019I目次前言................................................................................II1范围...............................................................................12规范性引用文件.....................................................................13术语和定义.........................................................................14缩略语.............................................................................15原理...............................................................................16材料及设备.........................................................................16.1试剂...........................................................................26.2仪器设备.......................................................................27生物安全措施.......................................................................28气溶胶样品的采集、保存及运输.......................................................28.1气溶胶样品的采集...............................................................28.2气溶胶样品的采集后的灭活处理...................................................28.3样品的保存和运输...............................................................29操作方法...........................................................................29.1气溶胶样本的前处理.............................................................29.2核酸提取.......................................................................39.3荧光定量PCR检测...............................................................310分析条件设定和结果判定............................................................310.1阈值设定......................................................................310.2质控..........................................................................310.3结果分析及判定................................................................311注意事项..........................................................................3附录A（资料性附录）主要仪器设备................................................4附录B（规范性附录）牛场环境气溶胶样本的采集方法和注意事项......................5附录C（资料性附录）气溶胶结核分枝杆菌复合群核酸荧光定量PCR检测结果图..........7附录D（规范性附录）检测过程防止交叉污染的措施..................................9DB37/T3624—2019II前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东师范大学。本标准主要起草人：王洪梅、何洪彬、赵贵民、侯佩莉、潘伟、何成强、于志君。DB37/T3624—20191牛场气溶胶结核分枝杆菌复合群荧光定量PCR检测技术规程1范围本标准规定了牛场环境气溶胶样本中结核分枝杆菌复合群核酸实时荧光定量PCR检测方法的技术要求和操作规范。本标准适用于牛场环境中气溶胶结核分枝杆菌复合群核酸的快速准确检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。Ct值CycleThreshold荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。4缩略语下列缩略语适用于本文件。MTC：结核分枝杆菌复合群，包括结核分枝杆菌（M.tuberculosis）、牛分枝杆菌（M.bovis）、非洲分枝杆菌（M.africanum）、坎纳分支杆菌（M.canettii）等（Mycobacteriumtuberculosiscomplex）AGI：全玻璃液体冲击式采样器（All-Glass-Impinger）5原理本标准采用SYBRGreenI染料实时荧光定量PCR技术。MTC细菌的分泌性蛋白MBP70基因非常保守，因此以它为目的基因设计引物，可以对结核病病原进行检测。6材料及设备DB37/T3624—20192试剂6.1.1试剂级别检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T6682的要求。6.1.2引物序列上游引物（MTC-F）：5’-TGACCAGCATCCTGACCTACC-3’。下游引物（MTC-R）：5’-CGGCGTTACCGACCTTGA-3’。引物在使用时用灭菌双蒸水稀释成10μmol/L工作液，置于-20℃保存。6.1.3主要组分SYBRGreenI荧光定量PCR反应缓冲液，采用商品化试剂。6.1.4对照设置阳性对照为灭活BCG疫苗菌株提取的基因组DNA，-20℃保存备用。阴性对照为采集自无结核病病原污染的净化健康牛场气溶胶样本提取的基因组DNA。仪器设备仪器设备及参数见附录A。7生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测结核分枝杆菌复合群核酸，所有检测样本应在Ⅱ级生物安全柜内操作。8气溶胶样品的采集、保存及运输气溶胶样品的采集应用空气微生物采样箱，使用国际标准的AGI采集样本。采集方法和注意事项见附录B。气溶胶样品的采集后的灭活处理样品采集后立即用70%乙醇溶液灭活处理。样品的保存和运输待检样品在2℃～8℃保存不应超过24h；-20℃保存不超过三个月；-80℃以下可长期保存。样品应置于低温（2℃～8℃）、密封的容器内运输。9操作方法气溶胶样本的前处理取30mL采集的气溶胶样本，12000r/min离心10min，弃上清，重悬沉淀物，继续进行核酸提取，或置-20℃备用。DB37/T3624—20193核酸提取采用商品化细菌基因组DNA提取试剂盒进行核酸提取。荧光定量PCR检测9.1.1反应液的配制采用20μL反应体系，每个反应管包含荧光定量PCR反应液（2×）：10.0μL，上、下游引物各0.8μL，检测模板或阴阳性对照2μL，灭菌蒸馏水6.4μL。需要配制的荧光定量PCR反应液管数为样品个数n+2（阳性对照）+2（阴性对照）+2（防止分装时液体损失）。按照顺序依次加入上述各荧光定量PCR反应组份的预混液，然后在每个PCR反应管中分装18μL。9.1.2加样在已分装有荧光PCR预混液的PCR光学管中每管分别加入2μL待检样品或对照模板，混匀，盖上管盖，放入荧光PCR仪，记录样品放置顺序。9.1.3荧光定量PCR扩增选择检测模式：SYBRGreenI。反应体系：20μL。反应条件设定：预变性：95℃30s，1个循环；PCR扩增：95℃5s，61℃30s，40个循环，61℃时采集荧光信号。熔解：95℃15s，65℃1min，95℃，Continuous；40℃10s。可根据不同品牌PCR仪器说明书等效设置参数。10分析条件设定和结果判定阈值设定综合分析仪器给出的各项结果，基线（Baseline）以仪器给出的默认值作为参考，阈值（Threshold）设定原则以阈值线刚好超过阴性对照样品扩增曲线的最高点为准，具体需根据仪器噪声情况进行调整，选择PCR扩增反应所设定的荧光基团对应的通道进行分析。质控质控有效的条件为：阴性对照和空白对照应无Ct值或≥35，阳性对照的Ct值应＜35，且呈现S型扩增曲线。结果分析及判定结核分枝杆菌复合群核酸阴性反应结果判定：检测结果呈现无Ct值、无扩增曲线、扩增反应曲线无明显对数增长期，判为荧光定量PCR阴性反应，样品判定为结核分枝杆菌复合群核酸检测阴性。结核分枝杆菌复合群核酸阳性反应结果判定：检测结果呈现Ct值＜35、扩增曲线有明显的对数增长期，且熔解曲线Tm值为（92.5±0.5）℃，判为荧光定量PCR结果阳性反应，样品判为结核分枝杆菌复合群核酸检测阳性。见附录C。11注意事项注意的事项见附录D。DB37/T3624—20194AA附录A（资料性附录）主要仪器设备A.1荧光定量PCR仪（全波长）。A.2台式离心机（转子容积2mL，50mL；最高离心力15000×g）。A.3电热恒温水槽（室温至100℃）。A.4涡旋振荡器。A.5天平（精密度千分之一以上）。A.6冰箱（2℃～8℃，-20℃，-80℃）。A.7微量可调移液器（0.25μL，10μL，100μL，200μL，1000μL）。A.8微量带滤芯吸头（10μL，100μL，1000μL）。A.9Ⅱ级生物安全柜A型。A.101.5mLEppendorf管。A.110.2mL8联排PCR反应管。A.12一次性手套。A.13一次性口罩。A.14医用废弃物容器。DB37/T3624—20195BB附录B（规范性附录）牛场环境气溶胶样本的采集方法和注意事项B.1采样环境环境温度≥5℃。B.2试剂0.9%灭菌生理盐水和橄榄油。B.3仪器与耗材空气微生物采样箱，Porton空气微生物采样器，三角支架，灭菌注射器（10mL），一次性口罩，一次性手套，一次性无菌隔离服。B.4采样人员要求现场采样的工作人员要穿工作服和胶鞋、戴上口罩、防风眼镜和一次性乳