SNP及检测关键技术专业资料

单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP），重要是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起DNA序列多态性。它是人类可遗传变异中最常用一种。占所有已知多态性90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，预计其总数可达300万个甚至更多。SNP所体现多态性只涉及到单个碱基变异，这种变异可由单个碱基转换（transition）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基插入或缺失所致。但普通所说SNP并不涉及后两种状况。单核苷酸多态性（SNP）是指在基因组上单个核苷酸变异，涉及置换、颠换、缺失和插入。所谓转换是指同型碱基之间转换,如嘌呤与嘌呤(G2A)、嘧啶与嘧啶(T2C)间替代;所谓颠换是指发生在嘌呤与嘧啶(A2T、A2C、C2G、G2T)之间替代。从理论上来看每一种SNP位点都可以有4种不同变异形式，但事实上发生只有两种，即转换和颠换，两者之比为2：1。SNP在CG序列上浮现最为频繁，并且多是C转换为T，因素是CG中C常为甲基化，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。普通而言，SNP是指变异频率不不大于1%单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000个碱基就有一种SNP，人类基因组上SNP总量大概是3×106个。根据排列组合原理,SNP一共可以有6种替代状况,即A/G、A/T、A/C、C/G、C/T和G/T,但事实上,转换发生频率占多数,并且是C2T转换为主,其因素是CpGC是甲基化,容易自发脱氨基形成胸腺嘧啶T，CpG也因而变为突变热点。理论上讲，SNP既也许是二等位多态性，也也许是3个或41定义：个等位多态性，但事实上，后两者非常少见，几乎可以忽视。因而，普通所说SNP都是二等位多态性。这种变异也许是转换（CT，在其互补链上则为GA），也也许是颠换（CA，GT，CG，AT）。转换发生率总是明显高于其他几种变异，具备转换型变异SNP约占2/3，其他几种变异发生几率相似。Wang等研究也证明了这一点。转换几率高，也许是由于CpG二核苷酸上胞嘧啶残基是人类基因组中最易发生突变位点，其中大多数是甲基化，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。SNP在动物基因组中分布广泛,每一种核苷酸发生突变概率大概为10-9。由于选取压力,SNP在单个基因、整个基因组中以及种群间分布是不均匀。SNP在非编码区中要多于编码区,并且在编码区也是非同义突变(有氨基酸序列变化)频率比其她方式突变频率低得多[4]。而基因间,同一种基因中编码SNP(codingSNP,cSNP)数目也不相似,可从0～29个不等。多项研究同步发现不同种族间SNPs数目也是不同,非洲人群及非裔种族中SNPs数量最多,而其她种群SNPs要少得多,因而通过比较亚群间等位基因频率将有助于阐明种族构造和进化。在基因组DNA中，任何碱基均有也许发生变异，因而SNP既有也许在基因序列内，也有也许在基因以外非编码序列上。总来说，位于编码区内SNP（codingSNP,cSNP）比较少，由于在外显子内，其变异2.SNP自身特性：率仅及周边序列1/5.但它在遗传性疾病研究中却具备重要意义，因而cSNP研究更受关注。从对生物遗传性状影响上来看，cSNP又可分为2种：一种是同义cSNP（synonymouscSNP），即SNP所致编码序列变化并不影响其所翻译蛋白质氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基含义相似；另一种是非同义cSNP（non-synonymouscSNP），指碱基序列变化可使以其为蓝本翻译蛋白质序列发生变化，从而影响了蛋白质功能。这种变化常是导致生物性状变化直接因素。cSNP中约有一半为非同义cSNP。先形成SNP在人群中常有更高频率，后形成SNP所占比率较低。各地各民族人群中特定SNP并非一定都存在，其所占比率也不尽相似，但大概有85%应是共通。1）SNP数量多，分布广泛。据预计，人类基因组中每1000个核苷酸就有一种SNP，人类30亿碱基中共有300万以上SNPs.SNP遍及于整个人类基因组中，依照SNP在基因中位置，可分为基因编码区SNPs（Coding-regionSNPs，cSNPs）、基因周边SNPs（PerigenicSNPs，pSNPs）以及基因间SNPs（IntergenicSNPs，iSNPs）等三类。2）SNP适于迅速、规模化筛查。构成DNA碱基虽然有4种，但SNP普通只有两种碱基构成，因此它是一种二态标记，即二等位基因（biallelic）。由于SNP二态性，非此即彼，在基因组筛选中SNPs往往只需+/-分析，而不用分析片段长度，这就利于发展自动化技术筛选或检测SNPs。3）SNP等位基因频率容易预计。采用混和样本估算等位基因频率是种高效迅速方略。该方略原理是：一方面选取参照样本制作原则曲线，然后将待测混和样本与原则曲线进行比较，依照所得信号比例拟定混和样本中各种等位基因频率。4）易于基因分型。SNPs二态性，也有助于对其进行基因分型。对SNP进行基因分型涉及三方面内容：（1）鉴别基因型所采用化学反映，惯用技术手段涉及：DNA分子杂交、引物延伸、等位基因特异寡核苷酸连接反映、侧翼探针切割反映以及基于这些办法变通技术；（2）完毕这些化学反映所采用模式，涉及液相反映、固相支持物上进行反映以及两者皆有反映。（3）化学反映结束后，需要应用生物技术系统检测反映成果。绝大多数疾病发生与环境因素和遗传因素综合伙用关于，普通以为是在个体具备遗传易感性基本上，环境有害因素作用而导致疾病。不同群体和个体对疾病易感性、抵抗性以及其她生物学性状（如对药物反映性等）有差别，其遗传学基本是人类基因组DNA序列变异性，其中最常用是SNP.易感基因特点是基因变异自身并不直接导致疾病发生，而只导致机体患病潜在危险性增长，一旦外界有害因素介入，即可导致疾病发生。此外在药物治疗中，易感基因变异导致药物对机体疗效和副作用不同。多态性与突变区别惯用数据库：随着人类基因组筹划进展，人们愈来愈相信基因组中SNP有助于解释个体表型差别、不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病易感性以及对各种药物耐受性和对环境因子反映。因而，寻找和研究SNP已成为人类基因组筹划内容和目的之一。1、多态性是一种群体概念，多态性指这个差别占群体1%以上。否则就叫突变（不大于1%）2、SNP是多态性中一种，只是进一步限定了差别只是单碱基。3、SNP普通来说，是所有体细胞同样基因型（除开嵌合体）。4、突变普通不是一种个体所有细胞变化。5、如果突变发生在生殖细胞，则可以遗传，但是只要这个突变群没有达到总群体1%，它就只是一种突变株/系。达到了1%就是多态性了。HumanGeneMutationDatabase(HGMD)////TheGenomeDatabase(GD)////DatabaseofSingleNuleotidePolymorphisms(dbSNP)////HumanGenomeVariationDatabase(HGVbase)////TheSnpConsortium，LTD.（TSC）////.org人们对SNP研究办法进行了许多摸索和改进。SNP分析技术按其研究对象重要分为两大类,即：①对未知SNP进行分析,即找寻未知SNP或拟定某一未知SNP与某遗传病关系。检测未知SNP有许各种办法可以使用,如温度梯度凝胶电泳(TGGE)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、单链构象多态性(SSCP)、变性高效液相色谱检测(DHPLC)、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)等,但这些办法只能发现具有SNPDNA链,不能确知突变位置和碱基类别,要想做到这一点,必要对那些具有SNPDNA链进行测序。②对已知SNP进行分析,即对不同群体SNP遗传多样性检测或在临床上对已知致病基因遗传病进行基因诊断。筛查已知SNP办法有等位基因特异寡核苷酸片段分析(ASO)、突变错配扩增检查(MAMA)、基因芯片技术(genechips)等。由于人类基因工程带动,许多物种都已开始了基因组项目,并建立了大量数据库,比较这些来自不同实验室不同个体序列，就可以检测到SNP。SNP位点信息已知状况下，选取SNPGENOTYPING办法，重要依照你经费状况设计，我分别给你分析一下现状：A、普通实验室：经费普通，仪器不具备时，最多用是如下两种办法：3.SNP既有检测技术1、基于PCR办法，也叫AS-PCR，(ALLELE-SPECIFICPCR)办法。重要原理是运用引物在扩增时3'端相对高BASE规定，进行设计。这个办法是最便宜，不需要酶切，一次PCR就可以得到GENOTYPING信息。缺陷：PCR对于3'端特异性在不同退火温度时有出入，因此退火温度摸索很核心，否则假阳性扩增是很容易。此外，内参照设立也很重要，这个东西还是很故意思。并且，所使用引物位置无法人为调节，只能放在SNP5'段。2、基于酶切分型。依托限制性内切酶忠贞性进行单SNP分型。SNP突变与否，也许影响某个酶辨认位点存在或消失。通过酶切产物电泳条带，判断SNP突变状况，即纯和，野生纯和，和杂和子。当没有直接可运用酶切位点时，可以采用突变引物中个别BASE，从而凑成切点设计，也叫做RG-PCR，restrictionsitegenerationPCR。B、有经费实验室办法：这里我写几种自己曾经涉足过办法，可行性比较强，但是需要相应经费支持和相应仪器，但是通量相对更高，效率更好：1、直接测序，基于PCR产物直接sequencing办法，比对序列成果，就可以进行SNP辨认和分析。2、分型质谱，华大生物信息平台那边可以外接服务，提供PCR产物即可。3、pyro-sequencing，微测序，中科院遗传所王沥研究员那里有可以联系外接服务。4、D-HPLC，变性高效液相色谱法。北京可以去联系做地方不少，北京大学生科院有机器，此外北京大学肿瘤研究所也有机器，国家人类基因组陈标那里也有一台，需要做话，拿着经费和她们联系就可以，这个办法也很不错，价钱可以商量。5、尚有些办法，如DNA芯片技术适合对于largescaleSNP筛查，普通用于组学领域，也许不合用与您状况。尚有许多如荧光共振能量转移等办法/探针杂交法等，并未在本领域中华人民共和国内推广，就不一一简介了。1）测序重要发现新SNP位点和比较集中SNP位点，如hla区域，但成本较高，工作量大，不适合大样本做疾病关联分析。2）taqman探针成果比较可靠，国外文章也大量应用，但是对于国内成本偏高，同类尚有snpshot技术，abi和贝克曼都相应试剂盒。成本和成功率都比taqman要低。3）snp芯片国外大规模筛查疾病关联分析惯用，illumina和affy均有不同密度成熟产品，单位点成本很低，但点较多，样本多时也会很高耗费，但成果精确，适合复杂疾病，有实力项目组普通大型机器点在384-群基因组可以订制，但成本会高；illumina开发了一台小芯片，极其适合1-384，可以订制，成本在2-5元/人点，但还没有很成熟流程，详细效果和成功率要进一步看。4）剩余就是老式办法如酶切，PCR-SSCP等，也有杂志接受，但普通需要测序验证。缺陷是工作量太大，成果不精确，不是所有位点都可以做，但成本很低。当前已有各种办法可用于SNP检测，如依照DNA列阵微测序法、动态等位基因特异杂交、寡聚核苷酸特异连接、DNA芯片以及TaqMan系统等。但不论哪一种办法，一方面必要进行靶序列扩增，然后才干进行其他检测。老式SNP检测办法是采用某些已有成熟技术，如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异寡聚核苷酸杂交(ASO)等。这些技术虽在某种限度上能完毕对SNP检测，但由于它们必要通过凝胶电泳进行检测，因而，距迅速、高效、自动化目的还相差甚远。老式RFLP只能检测到SNP一某些，测序技术既费时费力，又不易实现自动化，并且DNA链二级构造还容易导致人工假相，使测序成果浮现偏差，不适当于SNP检测；SSCP则很难满足自动化需要，难以大规模开展工作。因