DB13T 2746-2018 西伯利亚鲟种质鉴定规范

ICS67.120.30B51DB13河北省地方标准DB13/T2746—2018西伯利亚鲟种质鉴定规范2018-07-16发布2018-08-16实施河北省质量技术监督局发布DB13/T2746—2018I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由河北省农业厅提出。本标准起草单位：河北省海洋与水产科学研究院、河北农业大学海洋学院、保定市水产技术推广站、曲阳县满鑫鲟鱼繁育养殖有限公司。本标准主要起草人：肖国华、宫春光、高晓田、任雪莲、张建修、徐荣郅、王东辉、胡志山、殷蕊、张耀红。DB13/T2746—20181西伯利亚鲟种质鉴定规范1范围本标准规定了西伯利亚鲟（Acipenserbaerii）的学名与分类、生物学特征、生长与繁殖、遗传学特性、检测方法与检验规则。本标准适用于西伯利亚鲟的种质检测与鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18654.1养殖鱼类种质检验第1部分：检验规则GB/T18654.2养殖鱼类种质检验第2部分：抽样方法GB/T18654.3养殖鱼类种质检验第3部分：性状测定GB/T18654.4养殖鱼类种质检验第4部分：年龄与生长的测定GB/T18654.6养殖鱼类种质检验第6部分：繁殖性能的测定GB/T18654.13养殖鱼类种质检验第13部分：同工酶电泳分析GB/T18654.14养殖鱼类种质检验第14部分：DNA含量的测定GB/T18654.15养殖鱼类种质检验第15部分：RAPD分析3学名与分类3.1学名西伯利亚鲟（Acipenserbaerii）。3.2分类地位属鲟形目（Acipenseriformes）,鲟科（Acipenseridae）,鲟属(Acipenser)。4生物学特征4.1外部形态鱼体修长，呈纺锤形，横切呈五角形，向尾部延伸变细，吻长尖，口腹位，口裂较小，一字形。歪形尾，鳃盖骨愈合为一,鳃盖膜彼此不相连而与颊部相连。体裸露无鳞具5列骨板，1列背骨板，2列侧骨板，2列腹骨板；第一背骨板不是最大的骨板,身体最高点不在第一骨板处；侧骨板通常与躯干部颜色相似；腹骨板与背骨板间具有许多星状薄骨板或微小颗粒，吻须4根，介于吻突与口裂之间，稍靠近口裂。鳃耙有结节，一般为3个。鱼体背部呈淡灰黑色或暗褐色，两侧较淡，腹部为白色。西伯利亚鲟的外部形态见图1。DB13/T2746—20182图1西伯利亚鲟外形4.2可数性状背鳍鳍式：D.30～56。臀鳍鳍式：A.17～33。背骨板数：10～20。侧骨板数：37～56，通常为42～47。腹骨板数：7～16。第一鳃弓（左）外侧鳃耙数：20～49，通常为27～32。4.3可量性状比例西伯利亚鲟可量性状比例见表1。表1西伯利亚鲟的可量性状比例（平均值±标准差）项目指标8月龄鱼3龄鱼10龄鱼全长/体长a1.31±0.041.25±0.061.28±0.04体长/体高6.65±0.646.15±0.045.53±0.51体长/头长3.69±0.253.79±0.344.09±0.28头长/吻长1.74±0.172.09±0.182.09±0.17头长/眼径22.13±1.9723.52±6.7223.70±4.21头长/眼间距3.59±0.483.17±0.393.29±0.30头长/尾柄高8.47±1.236.39±1.515.75±1.01尾柄长/尾柄高2.84±0.642.28±0.572.5±0.52a采用从吻端到尾鳍基部的长度5生长与繁殖5.1生长在人工养殖条件下，不同年龄组的西伯利亚鲟鱼体长和体重范围见表2。DB13/T2746—20183表2西伯利亚鲟各年龄组体长和体重范围项目指标1龄鱼2龄鱼3龄鱼4龄鱼5龄鱼体长（cm）40～5050～7070～8590～100100～120体重（g）400～6001500～20003000～40005000～70007000～9000a依据北方地区流水养殖模式，年龄以周年计5.2繁殖性成熟年龄：自然条件下雌鱼为19龄～20龄，雄鱼为17龄～18龄；人工养殖条件下雌鱼为7龄以上，雄鱼为5龄以上。繁殖周期：野生状态下为2年以上；人工养殖条件下为1年以上。怀卵量占体重的10%～30%。6遗传学特征6.1西伯利亚鲟DNA含量西伯利亚鲟细胞中DNA含量为N=8.98±0.115pg。6.2生化遗传学特征西伯利亚鲟肝脏酯酶（EST）同工酶有6条酶带，电泳图及酶带电泳模式图见图2。1-电泳图谱，2-模式图图2西伯利亚鲟肝脏酯酶电泳图谱及模式图6.3分子遗传学标记6.3.1西伯利亚鲟特异性RAPD遗传图谱的建立及特征标记RAPD引物（CCGCCCAAAC）PCR扩增的结果如图3所示。DB13/T2746—201841-西伯利亚鲟池，2、3-西伯利亚鲟个体，4-marker图3RAPD引物的扩增产物6.3.2西伯利亚鲟微卫星DNA分子标记的建立采用14对微卫星引物进行基因型鉴定，西伯利亚鲟在这14对引物的等位基因长度范围见表3。基因型数据分析结果见图4。表314个微卫星引物序列及其在西伯利亚鲟的等位基因长度范围位点名称引物序列(5’-3’)等位基因长度范围(bp)Atr-1101F：TATCCCCTCCACTGGAAATR：GTTAAACATCCCTGCCTTCA143～203Atr-105F:CGATTTGATTGGCTCTTGTAR:TGCAAATAAATTGGAGCTGA157～173Atr-107F:GGCAGGATTACATCTCCTGAR:TTACTAACTGCTAGATAATACCTCTCT188～242Atr-109F:ACCCGAGCTGTCACATTACTR:AAAATAACGCGAATTCCTGA162～300Atr-114F:GCAATTCGTGTTATGTTCATTTR:TGCATTCAGAGAATAACCGA201～251Atr-117F:TGCATGACACAGGACTTACCR:TGCCTCTCAATAGCAACATC191～259Abr39F:ACCCGCAATTATTAGGACR:CAGGACAAACTCAGACCC178～276Abr40F:TCACGCAGTCTCACAAGGR:TTCAATGGCAAACAGCAC384～418Abr41F:ACACTATCCCGCCACAATR:CCACTGAAGCCATCATCT322～410Afu19F:CATCTTAGCCGTCTGTGGTACR:CAGGTCCCTAATACAATGGC120～139Afu22F:TCCACAATCCTGAATAATGACR:GCACCATCTAATACGAAATTG140～242Afu39F:TTCTGAAGTTCACACATTGR:ATGGAGCATATTGGAAGG119～140Afu54F:CTCTAGTCTTTGTTGATTACAGR:CAAAGGACTTGAAACTAGG149～221Afu68F:TTATTGCATGGTGTAGCTAAACR:AGCCCAACACAGACAATATC128～250DB13/T2746—201851、西伯利亚鲟品种池，2、非西比利亚鲟样品。图4微卫星标记基因型数据分析结果图7检测方法7.1抽样方法按GB/T18654.2执行。7.2性状检测按GB/T18654.3执行。7.3年龄与生长测定按GB/T18654.4执行。7.4繁殖性能测定按GB/T18654.6执行。7.5DNA含量测定按GB/T18654.14执行。7.6同工酶测定样品制备、电泳分析按GB/T18654.13执行。7.7分子遗传学标记方法7.7.1DNA的提取DNA的提取按GB/T18654.15执行。7.7.2PCR扩增反应扩增反应总体积为25µL，其中包括摸板DNA30ng、10×PCR缓冲液（含Mg2+）2.5µL、dNTPS（2.5mMeach）2µL、Taq酶（5u/µL）0.3µL、引物1pM（RAPD法和微卫星DNA法分别使用各自的引物）。RAPD法反应程序为：95℃预变性5min，94℃45s、36℃45s、72℃90s，45cycles，72℃延伸5min。DB13/T2746—20186微卫星DNA法反应程序为：94℃变性45s、退火45s（各引物退火温度详见表4）、72℃延伸45s，40cycles，72℃再延伸5min。扩增反应结束后，取5µL产物与1µL上样缓冲液混合点样，在含溴化乙锭的1.4%琼脂糖凝胶中电泳1h～2h，电压80v，紫外灯下观察结果并拍照记录。表414个微卫星位点重复序列结构和退火温度位点名称重复序列结构退火温度（℃）Atr-1101(TATC)1055Atr-105(GATA)1550Atr-107(TAGA)1757Atr-109(GA)5(TAGA)2055Atr-114(TAGA)2360Atr-117(GATA)855Abr39(TATC)1858Abr40(TCTA)6(TAGA)1261Abr41(TCTA)1765Afu19(TTG)553Afu22(TAAA)5(GAA)1952Afu39(CAA)1455Afu54(GATA)2(GATA)255Afu68(GATA)21557.7.3结果分析7.7.3.1RAPD法结果分析向PCR产物中加入上样缓冲液，94℃解链5min，迅速置于冰中冷却至室温，4℃保存备用。使用95%酒精把长板擦洗一遍，待酒精挥发后涂1.5mL亲和溶液；再使用95%酒精把短板也擦洗一遍，待酒精挥发后涂200µL剥离溶液。取6%变性聚丙烯酰胺溶液80mL，加入60µL四甲基乙二胺，180µL的10%过硫酸铵（现用现配），充分混匀后灌入两块玻璃之间。用鲨鱼齿梳子的背面沿两玻璃板缝隙水平插入胶中约5mm～6mm。等约1.5h待凝胶聚合后，拔出梳子，用水将玻璃板表面冲洗干净，擦干后装在电泳槽上。向电泳槽的上下缓冲液槽中加入0.5×TBE缓冲液，使缓冲液没过短板。1800V恒压预电泳20min。预电泳之后，在每个加样孔中加入5µL解链后样品，1800V恒压电泳1.5h～2.5h。电泳结束后，小心分离两块玻璃板，将粘有凝胶的长板浸入染色液中，染色5min～15min，用蒸馏水漂洗30s，浸入在显影液中显影至带型清晰，再用蒸馏水漂洗5min。晾干长板后，拍照记录结果。7.7.3.2微卫星DNA法结果分析使用普通微卫星引物进行PCR扩增时，基因型判读同上述RAPD法。使用荧光微卫星引物进行PCR扩增时，直接使用基因分析仪进行基因型判读。使用软件STRUCTURE2.3对基因型数据进行综合分析。8检验与判定规则检验规则按GB/T18654.1执行，各项检测指标均符合第4、5、6条规定则判定为西伯利亚鲟。_________________________________