DB13T 5143-2019 畜禽组织及体液中多种抗生素残留快速检测 微生物抑制法

ICS07.080B41DB13河北省地方标准DB13/T5143—2019畜禽组织及体液中多种抗生素残留快速检测微生物抑制法2019-12-27发布2020-01-28实施河北省市场监督管理局发布DB13/T5143—2019I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由河北省农业农村厅提出。本标准起草单位：河北省兽药监察所、河北科星药业有限公司、北京中检葆泰生物技术有限公司、邢台市动物卫生监督所、衡水市农业环境与农畜产品质量监督管理站、沧州市农产品质量检验监测中心、承德市畜禽水产品质量检验监测中心、石家庄市畜产品质量监测中心、石家庄市畜牧兽医技术开发中心、唐山市食品药品综合检验检测中心。本标准主要起草人：刘怡菲、王萍、王振来、刘龙飞、牛志勇、钱春彩、段培姿、王爱卿、刘力、李云、张峰、闫超、李海龙、李文香、李研东、武侠均、赵芳、崔沙沙、陈宝明、李肖莉。DB13/T5143—20191畜禽组织及体液中多种抗生素残留快速检测微生物抑制法1范围本标准规定了畜禽组织及体液中β-内酰胺类、磺胺类、氟喹诺酮类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类、酰胺醇类七大类抗生素残留的微生物抑制法的制样和检测方法。本标准适用于畜禽肾脏、肝脏、肌肉、血清和尿液中β-内酰胺类、磺胺类、氟喹诺酮类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类、酰胺醇类七大类抗生素残留的快速检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理通过抑制微生物生长的检测方法来检测畜禽组织或体液中的抗生素。细菌在含有pH指示剂的琼脂中培养，使用拭子对畜禽组织或体液进行提取，如果样品中不含有抗生素，细菌生长不受抑制，产生的酸会使含有紫色指示剂的琼脂变成黄色；如果样品中含有抗生素，细菌生长会受到抑制，指示剂显示紫色。4试剂和材料除另有说明外，本法所用的试剂确认为分析纯试剂，水为符合GB/T6682规定的二级水。4.1检测试剂盒a)检测棒；b)取样拭子；c)洗脱反应缓冲液；d)检测微管（含有微生物的固化培养基）；e)阴性质控片：冷藏保存（2℃～8℃）；f)阳性质控片Ⅰ：青霉素G标准品固体；g)阳性质控片Ⅱ:庆大霉素标准品固体；h)反应药片：用于尿液和血清样品的检测，冷藏保存（2℃～8℃）。注：检测试剂盒是由CharmScience公司提供的产品。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。4.2阴性质控样品制备DB13/T5143—201924.2.1组织类阴性质控样品制备：取出1片阴性质控片（4.1.2）放置在提供的带有螺帽的离心管中，加入1.0mL水，振荡10s使阴性质控片（4.1.2）充分溶解。放置5min后再次振荡，制成阴性质控样品溶液,冷藏保存（2℃～8℃）,保存期为5d。4.2.2血清和尿液阴性质控样品：直接使用阴性血清或阴性尿液样品作为阴性质控样品。4.3阳性质控样品Ⅰ的配制（用于肾脏、肝脏、肌肉、家畜血清和尿液样品的测定）：用0.8mL阴性质控样品（4.2）溶解阳性质控片Ⅰ（4.1.3），制成浓度为50ng/mL的阳性质控样品Ⅰ。阳性质控样品Ⅰ可冷藏保存（2℃～8℃）72h；制备后6h内置于-15℃以下冷冻，可保存3周，解冻的阳性质控样品可冷藏保存（2℃～8℃）24h。4.4阳性质控样品Ⅱ制备（用于家禽血清样品的检测）：用10mL水溶解阳性质控片Ⅱ（4.1.4），制得浓度为5000ng/mL的标准溶液。取0.75mL上述标准溶液，加入4.25mL阴性血清，制得阳性质控样品Ⅱ，庆大霉素浓度为750ng/mL。5仪器设备a)孵育器：温度设置64℃±1℃；b)结果判读卡：见附录B；c)离心机：最高离心力大于1200g；d)移液器及吸头：100μL～1000μL、20μL～200μL和1mL～5mL；e)离心管：2mL、10mL和50mL。注：结果判读卡是由Charmcience公司提供的产品。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。6分析步骤6.1试样制备6.1.1肾脏和肝脏样品制备将取样拭子（4.1.1.1）从检测棒中拔出,使用检测棒露出的开口端，插入新鲜的肾脏或肝脏皮质约1cm～2cm做环形切割，取渗出液用于检测。6.1.2肌肉样品制备将肌肉样品匀质后速冻，然后快速解冻，将取样拭子（4.1.1.1）从检测棒中拔出,使用检测棒露出的开口端，插入肌肉组织约1cm～2cm做环形切割，取渗出液用于检测。6.1.3血清样品制备将血液收集于50mL离心管（5.5）中，放置4h，弃去凝块，离心剩余液体（1200g，5min），收集上清液。移取500μL上清液至离心管中。加入反应药片（4.1.5），盖上离心管，10s内点动式涡旋混合10次，翻转3～5次，确保药片充分溶解。再次10s内点动式涡旋混合10次，静置1min。6.1.4尿液样品制备DB13/T5143—20193移取500μL清亮的尿液于离心管中（如尿液浑浊，则1200g离心5min，取上清液备用），加入反应药片（4.1.5）。盖上离心管，10s内点动式涡旋混合10次，翻转3～5次，确保药片充分溶解。再次10s内点动式涡旋混合10次，静置1min。6.2样品移取6.2.1肾脏、肝脏和肌肉样品握住取样拭子（4.1.1.1），将棉签头插入肾脏、肝脏或肌肉组织的环形切口，顺时针移动同时旋转约30s，使拭子吸附汁液至完全浸湿，去除拭子上的组织颗粒。6.2.2血清和尿液样品打开离心管，将取样拭子（4.1.1.1）从检测棒中拔出，浸入样品上清液中，浸泡10s。6.3样品检测6.3.1将孵育器（5.1）设置为64℃，待温度稳定后进行检测。6.3.2垂直缓慢旋转手柄，把取样拭子（4.1.1.1）插入检测棒中，先拧到一半，使拭子刺破上层密封箔膜并完全浸没到上层洗脱反应缓冲液(4.1.1.2)中，但不刺破下层密封箔膜，等待2min。旋下拭子，使拭子到达微管底部琼脂上方，轻敲微管底部使上层液体完全进入微管底部，旋出拭子，再次轻敲微管底部5次，按照检测试剂盒标注时间孵育。孵育结束，取出微管放至室温。7结果判定与结果判读卡（5.2）进行颜色比对，目视判定。a)阴性：琼脂颜色为黄色或者黄/绿色为阴性结果；b)可疑：琼脂下半部分为黄色或黄绿色，上半部分为蓝色/紫色或棕色为可疑结果；c)阳性：琼脂颜色为蓝/紫色为阳性结果。8阳性样品和可疑样品确认当样品检测结果判为阳性或可疑时，应采用国家标准方法进行确证。9检出限方法检出限见表1。表1方法检出限表药物名称英文名称检出限(μg/kg)肾脏、肝脏、肌肉、家禽血清家畜血清和尿液青霉素GPenicillinG3535氨苄西林Ampicillin4040阿莫西林Amoxicillin4040DB13/T5143—20194表1方法检出限表（续）药物名称英文名称检出限(μg/kg)肾脏、肝脏、肌肉、家禽血清家畜血清和尿液氯唑西林Cloxacillin200200苯唑西林Oxacillin150150头孢噻呋Ceftiofur*800800头孢匹林Cephapirin*100100头孢氨苄Cefalexin150150头孢喹肟Cefquinome4040甲氧苄啶Trimethoprim4040磺胺二甲氧嗪Sulfadimethoxypyrimidine5050磺胺二甲嘧啶Sulfadimidine3030磺胺甲基异恶唑Sulfisoxazole7070磺胺甲氧嗪Sulfamethoxypyridazine7070磺胺甲嘧啶Sulfamerazine5050磺胺类Sulfonamide3030达氟沙星Danofloxacin4040二氟沙星Difloxacin200200恩诺沙星Enrofloxacin6060氟甲喹Flumequine400400沙拉沙星Sarafloxacin88洛美沙星Lomefloxaxin11氧氟沙星Ofloxacin11诺氟沙星Norfloxacin11培氟沙星Pefloxacin11恶喹酸OxolinicAcid8080土霉素Oxytetracycline150150四环素Tetracycline100100金霉素Chlortetracycline150150多西环素Doxycycline7070泰乐菌素Tylosin6565红霉素Erythromycin7070吡利霉素Pirlimicin*8080替米考星Tilmicosin5050DB13/T5143—20195表1方法检出限表（续）药物名称英文名称检出限(μg/kg)肾脏、肝脏、肌肉、家禽血清家畜血清和尿液拖拉霉素Tulathromycin*400400螺旋霉素Spiramycin150150林可霉素Lincomycin5050庆大霉素Gentamicin5050链霉素Streptomycin400400双氢链霉素Dihydrostreptomycin400400卡那霉素Kanamycin7070新霉素Neomycin400400大观霉素Spectinomycin400400新生霉素Novobiocin10001000杆菌肽（枯草杆菌素）Bacitracin350350氯霉素Chloramphenicol0.10.1氟苯尼考Florfenicol8080甲砜霉素Thiamphenicol4040喹乙醇Olaquindox22DB13/T5143—20196附录A（资料性附录）KIS检测棒示意图图A.1KIS检测棒示意图DB13/T5143—20197附录B（资料性附录）结果判读卡示意图图B.1结果判读卡示意图