DB22T 2051-2014 饲料中肉毒梭菌测定 PCR方法

ICS07.100.30B20备案号：41839-2014DB22吉林省地方标准DB22/T2051—2014饲料中肉毒梭菌测定PCR方法DeterminationofClostridiumbotulinuminfeedstuffsPCRmethod2014-02-28发布2014-04-30实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2051—2014I前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国顺德出入境检验检疫局。本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、邵秋荣、刘斌、周亮、刘晓晖、王潇、任明月。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2051—20141饲料中肉毒梭菌测定PCR方法1范围本标准规定了饲料中肉毒梭菌的PCR检验方法。本标准适用于饲料中A、B、E、F型肉毒梭菌的快速筛选检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1肉毒梭菌clostridiumbotulinum肉毒梭菌为梭菌科梭菌属革兰氏阳性芽孢杆菌，厌氧，在适宜的培养基及特定的环境条件下产生一类具有很强毒性的神经麻痹毒素，即肉毒毒素。4原理样品增菌后，培养物经DNA提取制备PCR模板，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物是否有特征条带，从而对饲料中是否污染肉毒梭菌进行快速检验。5试剂除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.1引物：见表1。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2051—20142表1引物序列目标菌类型引物序列扩增长度bp上游引物：5’-GTGATACAACCAGATGGTAGTTATAG-3’A型下游引物：5’-AAAAAACAAGTCCCAATTATTAACTTT-3’983上游引物：5’-GAGATGTTTGTGAATATTATGATCCAG-3’B型下游引物：5’-GTTCATGCATTAATATCAAGGCTGG-3’492上游引物：5’-CCAGGCGGTTGTCAAGAATTTTAT-3’E型下游引物：5’-TCAAATAAATCAGGCTCTGCTCCC-3’410上游引物：5’-GCTTCATTAAAGAACGGAAGCAGTGCT-3’F型下游引物：5’-GTGGCGCCTTTGTACCTTTTCTAGG-3’11375.2疱肉培养基：见附录A.1章。5.3胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉汤（TPGY）：见附录A.2章。5.4厌氧卵黄琼脂：见附录A.3章。5.5细菌基因组DNA提取纯化试剂盒。5.6TaqDNA聚合酶。5.7dNTP：dATP（deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dGTP（deoxyguanosinatriphosphate，脱氧鸟苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidinetriphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dTTP（deoxythymidinetriphosphate，脱氧胸苷三磷酸）。5.8溶菌酶。5.9蛋白酶K。5.10无水乙醇。5.11十二烷基硫酸钠（SDS）。5.12蔗糖。5.13三羟甲基氨基甲烷（Tris）。5.14乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na2·2H2O）。5.1510×PCR缓冲液：含200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化钾（KCl），15mmol/L氯化镁（MgCl2）。5.16分子量标记：100bp～3000bpDNAMarker。5.17琼脂糖：电泳级。5.18溴化乙锭。5.19EDTA溶液，0.5mol/L，pH8.0：称取186.1gEDTA-Na2·2H2O，加入700mL去离子水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用10mol/L氢氧化钠调pH值至8.0，用水定容到1L，分装后高压灭菌。5.20Tris-HCl，1mol/L，pH8.0：在800mL去离子水中溶解121.1gTris，冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的pH值至8.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。5.21TE缓冲液（pH8.0）：在800mL水中，依次加入10mL的1mol/LTris-HCl（pH8.0）和2mL的0.5mol/LEDTA（pH8.0），用水定容到1L，分装后高压灭菌。5.22溶菌酶溶液：用TE配制，使用浓度为10mg/mL。5.23蛋白酶K溶液：用高压灭菌的去离子水溶解蛋白酶K为10mg/mL的溶液，分装后于-20℃保存，避免反复冻融。5.2420%SDS溶液：将20gSDS溶解在100mL去离子水中。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2051—201435.2550×TAE电泳缓冲液（储备液）：称取484gTris，量取114.2mL冰醋酸，200mL0.5mol/LEDTA溶液（pH8.0），溶于水中，定容至2L。分装后高压灭菌备用。使用前稀释成1×TAE电泳缓冲液（工作液）。5.26加样缓冲液：称取溴酚蓝250mg，加水10mL，在室温下过夜溶解；再称取二甲腈蓝250mg，用10mL水溶解；称取蔗糖50g，用30mL水溶解，合并三种溶液，用水定容至100mL，在4℃保存。5.27阳性对照：含有扩增片段的质粒或A、B、E、F型肉毒梭菌的基因组DNA。6仪器和设备6.1厌氧培养装置。6.2生物安全柜：AII型。6.3恒温培养箱：35±1℃℃和28±1℃℃。6.4高压灭菌器。6.5高速冷冻离心机：转速≥12000r/min。6.6PCR仪。6.7电泳仪。6.8凝胶成像分析系统。6.9核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.10恒温水浴锅。6.11天平：感量0.1g。6.12均质器或灭菌研钵。6.13微量移液器：0.2μL～2μL、2μL～10μL、20μL～200μL、100μL～1000μL。6.14离心管：1.5mL。7检测7.1样品制备与增菌培养样品经均质处理后及时接种培养。接种前，先将增菌培养基煮沸10min～15min，以排除溶解于培养基中的氧，并迅速冷却，切勿摇动。每15mL增菌肉汤中接种1g～2g样品，接种时将接种物慢慢接入肉汤液面以下。每份样品接种两管疱肉培养基，置35℃±1℃，同时接种两管TPGY培养基，置28℃±1℃，厌氧培养5d。检查培养物的浊度、产气、肉粒的消化和产生的气味。若有生长，按7.2分离纯培养物。若未见生长，可再培养10d。7.2分离纯培养物取1mL～2mL培养液置于螺旋帽试管中，加入等量过滤除菌的无水乙醇。混匀，在室温下放置1h。或80℃加热10min～15min以破坏其繁殖体。用接种环取1环～2环经乙醇或加热处理的培养物在厌氧卵黄琼脂上划线接种，置厌氧条件下35℃±1℃培养48h。挑取约10个单个的典型菌落。肉毒梭菌的菌落为隆起或扁平，光滑或粗糙，容易蔓延生长并有不规则边缘。在卵黄培养基上用斜射光检查时，菌落表面通常呈虹彩样，亦称为珠色层。彩带通常向外延伸，继而菌落产生不规则外形。接种可疑菌落到TPGY培养基中，置35℃±1℃厌氧培养24h。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2051—20144培养液一部分用于DNA提取，剩余培养液置于4℃保存，以备确证试验使用。7.3DNA提取取1.4mLTPGY培养物转移至1.5mL离心管中，12000r/min离心2min，弃去上清液。菌体沉淀用1.0mLTE缓冲液洗两次后重悬于120μL的25%蔗糖溶液中。加入10mg/mL溶菌酶溶液120μL，混匀，37℃±1℃水浴30min；然后加入20%SDS溶液30μL，轻轻混匀，室温放置5min；再加入10mg/mL蛋白酶K溶液9.0μL，混匀后37±1℃℃水浴30min。悬浮液采用细菌基因组DNA提取纯化试剂盒并按试剂盒说明书进行操作。提取的DNA溶液可于-20℃保存。7.4DNA浓度测定取10μLDNA溶液加蒸馏水稀释至1mL，使用核酸蛋白仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值。DNA的浓度按照式（1）计算，当A260/A280比值在1.5～2.1之间时，适宜于PCR扩增。扩增前将所有样品DNA调至10ng/μL～50ng/μL。501000ANc´´=.............................................................................................(1)式中：c——DNA浓度，单位为纳克每微升（ng/μL）；A——260nm处的吸光值；N——核酸稀释倍数。7.5PCR检验7.5.1PCR反应体系10×PCR缓冲液2.5μL、dNTP(10mmol/L)0.5μL、上下游引物（10μmol/L）各1μL、TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.25μL、DNA模板（10ng/μL～50ng/μL）2μL、用无菌去离子水补足体积至25μL。针对A、B、E、F型肉毒梭菌，进行多个PCR扩增，每个PCR反应管检测一种类型的肉毒梭菌。7.5.2反应条件95℃预变性5min，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，40个循环，72℃后延伸10min。结束反应，4℃保存。不同仪器、不同TaqDNA聚合酶可根据要求将反应条件做适当调整。检验过程中分别设空白对照、阴性对照、阳性对照。空白对照设为以无菌水代替DNA模板；阴性对照采用非肉毒梭菌的DNA作为PCR反应的模板；阳性对照采用含有扩增片段的质粒或A、B、E、F型肉毒梭菌的基因组DNA作为PCR反应的模板。7.5.3扩增产物电泳检测取1.2g～1.5g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/mL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5µL～8μLPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样，用分子量标记作参照。9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。8结果判定本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2051—201458.1阴性对照和空白对照均未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带，待测样品出现预期大小的扩增条带，判定为PCR结果阳性，按附录B进行确证试验。8.2阴性对照和空白对照均未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带，待测样品未出现预期大小的扩增条带，判定为PCR结果阴性，可直接报告。8.3实验中设置的阴性对照、空白对照和阳性对照PCR检测结果应符合上述情况。否则，任一种对照如果出现非上述正常结果，应重做试验。9结果表述9.1PCR结果阴性，直接报告“未检出A、B、E、F型肉毒梭菌”。9.2确证试验结果为检出肉毒梭菌，则报告“检出A、B、E、F型肉毒梭菌”。9.3确证试验结果为未检出肉毒梭菌，则报告“未检出A、B、E、F型肉毒梭菌”。10生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测，所有培养物应小心处置，并按GB/T27403中的有关规定执行。11废弃物处理和防止污染的措施11.1检验过程中的废弃物需经121℃高压灭菌处理至少30min后再弃置。11.2检验过程中防止交叉污染的措施按GB/T27403执行。本标准仅供内部使用不得翻印