杭州师范大学生命与环境科学学院

SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量一、实验目的了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量。二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。SDS是十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate）的简称，它是一种阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，就可根据标准蛋白质的相对分子量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白质的相对分子质量。本实验用目前常用的垂直平板电泳，样品的起点一致，便于比较。三、实验器材1.直流稳压电泳仪2.垂直平板电泳槽（含玻璃板、夹条、梳齿、夹子等）3.移液器（1.0ml、200μl、20μl）4.微量注射器（20μl）5.烧杯、培养皿、试管、滴管、直尺6.脱色摇床四、实验试剂1.凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr）29.2g和亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g重蒸水溶解后，定容至100ml，棕色试剂瓶4℃保存，30天内使用。2.分离胶缓冲液：1.5mol/LTris-HCl，pH8.8。18.15Tris（三羟甲基氨基甲烷），少许重蒸水溶解，用1MHCl调pH8.8，重蒸水定容至100ml，4℃保存。3.浓缩胶缓冲液：0.5mol/LHCl，pH6.8。6gTris,少许重蒸水溶解，用1MHCl调pH6.8，重蒸水定容至100ml，4℃保存。4.10%SDS，室温保存。5.两类样品缓冲液：2倍还原缓冲液（2×reducingbuffer）0.5mol/LHCl，pH6.82.5ml甘油2.0ml质量浓度10%SDS4.0ml质量浓度0.1%溴酚蓝0.5mlβ-巯基乙醇1.0ml总体积10ml四、实验试剂6.电极缓冲液，pH8.3。Tris3g，甘氨酸14.4g，SDS1.0g加重蒸水溶解定容至1000ml，4℃保存。7.低分子量标准蛋白质（上海产）。开封后溶于200μl重蒸水，加200μl2倍样品缓冲液（还原缓冲液），分装20小管，-20℃保存。临用前沸水浴3～5min，其相对分子量（Mr）如下：兔磷酸化酶B97400牛血清白蛋白66200兔肌动蛋白43000牛碳酸酐酶31000胰蛋白酶抑制剂20100鸡蛋清溶菌酶144008.质量浓度为10%过硫酸铵：（临用前配制）9.染色液：0.25g考马斯亮蓝R250，加入40ml甲醇，10ml冰醋酸,蒸馏水定容至100ml，过滤。10.脱色液：50ml甲醇，75ml冰醋酸与875ml重蒸水混合。11.待测蛋白样品。12.1%琼脂糖（最好用电极液配）13.TEMED五、实验步骤1、洗净晾干电泳槽、玻璃板、夹条、梳齿等。安装后用1%琼脂糖封玻璃板两侧及底部。2、分离胶的选择和配置方法12）分离胶和浓缩胶的配制方法分离胶的浓度12%浓缩胶的浓度5%重蒸水/ml3.35重蒸水/ml2.921.5MTris-HCl(pH8.8)/ml2.50.5MTis-HCl(pH6.8)/ml1.2510%SDS/ml0.110%SDS/ml0.05凝胶贮备液(Acr/Bis)/ml4.0凝胶贮备液(Acr/Bis)/ml0.810%过硫酸铵/μl5010%过硫酸铵/μl25TEMED/μl（最后加，防烧杯中聚合）5TEMED/μl5总体积/ml10ml总体积/ml5ml五、实验步骤3、分离胶的灌制按照上表左边操作。因加入TEMED后凝胶就开始聚合，故应立即混匀混合液，然后用滴管吸取分离胶，在电泳槽的两玻璃之间灌注，避免气泡。留出梳齿的齿高加1cm空间以便灌注浓缩胶。用滴管小心地在溶液上覆盖一层重蒸水，将电泳槽垂直静置于室温下约40～60min，待分离胶聚合完全后，除去覆盖的重蒸水。4、浓缩胶的灌制（等分离胶聚合后配制）按照上表右边操作。混匀后灌注在分离胶上。小心插入梳齿，避免混入气泡，将电泳槽垂直静置于室温下至浓缩胶完全聚合（约40min）。5、样品的制备1）标准蛋白样品的制备（样品约5-10μg，最好离心取上清加样）取分装好的20μl低相对分子质量标准蛋白质，放入沸水浴中加热3～5min，取出冷却。2）待测样品的制备（同标准蛋白质样品处理）6、电泳1）待浓缩胶完全聚合后，标记好加样孔位置，将电泳槽注满电极缓冲液，小心拔出梳齿，用电极缓冲液冲洗加样孔数次。2）用微量注射器按次序向加样孔内加样。3）接上电泳仪，上电极接电源负极，下极接正极。打开电源，调节电流至20～30mA并保持电流强度恒定。待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距凝胶下端约1cm时，停止电泳。五、实验步骤7、染色与脱色小心将胶取出，置于一大培养皿中。加染色液染色30min，倾出染色液，加入脱色液，数小时更换一次脱色液，直至背景清晰。8、相对分子量的计算用直尺分别量出标准蛋白质、待测蛋白质区带中心以及溴酚蓝前沿距分离胶顶端的距离，按下式计算相对迁移率（R）：相对迁移率=样品迁移距离（cm）/指示剂迁移距离（cm）以标准蛋白质Mr的常用对数（lgMr）对相对迁移率作图，得到标准曲线。根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子量的常用对数，再换算出其相对分子量。