第六章水体污染与自净

一、实验目的•掌握微生物常规培养基的制备方法•学习无菌技术•学习玻璃器皿的包扎微生物培养基的配制与无菌技术二、实验内容1、6种培养基的配制•牛肉膏蛋白胨培养基（细菌）•高氏一号培养基（放线菌）•马丁氏培养基（真菌）•淀粉培养基（淀粉水解试验）•蛋白胨水培养基（吲哚试验）•葡萄糖蛋白胨水培养基（V.P试验）2、移液管、培养皿、三角瓶、试管等的包扎3、灭菌微生物培养基的配制无菌水的准备三、实验原理培养基medium:用人工的办法将多种营养物质按微生物生长代谢的需要配制成的营养基质。水、C源、N源、矿物质、生长因素/因子、微量元素培养基种类：天然培养基、合成培养基、半合成培养基固体培养基、液体培养基、半固体培养基基础培养基、加富培养基、选择性培养基、鉴别培养基微生物培养基的配制四、实验步骤配制培养基的流程：•原料称量、溶解•调节pH值•(加琼脂熔化)•(过滤)定容•分装•塞棉塞/扎口•灭菌培养基分装装置斜面摆放法棉塞的做法a)棉塞的制作过程(b)正误棉塞培养皿的包扎五、无菌技术•在(利用微生物)进行研究实验或生产过程中，采用物理和化学的方法技术，保证培养物不受环境微生物的污染，同时也不允许操作的微生物扩散到环境中去。•如高温灭菌、过滤、紫外线照射处理等。五、无菌技术灭菌与消毒•灭菌Sterilization：用物理或化学的方法来杀死或除去材料上或环境中的所有微生物的处理。•消毒Disinfection：用物理或化学的方法杀死物体上绝大部分微生物（主要是病原微生物和有害微生物）的处理。消毒实际上是部分灭菌。防腐(Antisepsis)：防止或抑制霉腐微生物在食品等物质上的生长化疗(Chemotherapy)：杀死或抑制宿主体内的病原微生物抑制(Inhibition)：生长停止，但不死亡死亡(Death)：生长能力不可逆丧失常用的灭菌方法•干热灭菌•热蒸汽灭菌•常压灭菌•过滤除菌•射线灭菌•化学药物灭菌1、火焰灭菌•微生物接种工具如接种环、接种针或其它金属用具等可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌。•这种方法灭菌迅速彻底。•接种过程中，试管或三角瓶口等，也可通过火焰灼烧灭菌。2、干热灭菌用干燥热空气（160℃,1~2h）杀死微生物•培养皿、漏斗、吸管、玻璃器具、解剖刀，接种、镊子、剪刀等能耐高温的器皿•晾干后用牛皮纸包好•温度升到100℃，开箱内鼓风机•培养基、橡胶塑料制品不能用此方法•注意安全干热灭菌箱鼓风钮温度调节器指示灯温度调节旋扭温度计与排气孔3、湿热灭菌•常压蒸汽间歇灭菌将待灭菌的培养基或物品装入常压灭菌器内，加热至100℃大量产生气体时,维持30—60min,每天灭菌一次,连续灭菌三天.每次蒸煮间隙里,培养基或物品应放在室温(20--30℃)条件下培养,第一次蒸煮杀死微生物的营养体,芽孢则在培养过程中萌发成营养体;第二次蒸煮即可杀死.经过二次培养,三次反复蒸煮,即可达到完全灭菌。•常压蒸汽持续灭菌•高压蒸汽灭菌3、湿热灭菌•常压蒸汽间歇灭菌•常压蒸汽持续灭菌常压蒸汽持续灭菌中,从蒸汽大量产生开始,继续加大火力保持充足蒸汽,持续加热3—6h,杀死绝大部分芽孢和全部营养体,达到灭菌目的。•高压蒸汽灭菌3、湿热灭菌•高压蒸汽灭菌原理：水的沸点随压力的增加而提高。水在密闭的加压蒸汽灭菌器中煮沸，产生蒸汽驱除锅内冷空气后，使蒸汽不能逸出，因而增加了锅中的蒸汽压力。蒸汽压力提高，水的沸点随着上升，因而能够获得比100℃更高的蒸汽温度，用来进行有效的灭菌。同一温度下，湿热灭菌法比干热灭菌法效果好–蒸汽穿透力强–蛋白质含水量高，易于凝固手提式灭菌锅安全阀压力表放气阀软管紧固螺栓灭菌桶筛架水卧式灭菌锅•是指含菌液体或气体通过细菌滤器，使杂菌留在滤器或滤板上，从而除去杂菌。•常用于许多不宜用湿热灭菌的液体物质，如抗生素、血清、糖类溶液等。•用于除菌的细菌过滤器，是由孔径极小，能阻止挡的陶瓷、硅藻土、石棉或玻璃粉等制成.为了加快过滤,一般多采用抽气减压的方法,进行操作。4、过滤除菌过滤除菌•辐射灭菌(RadiationSterilization)是利用电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法。•用于灭菌的电磁波有微波，紫外线(UV)、X-射线和γ-射线等。5、射线灭菌•酚类——损伤微生物细胞壁和细胞膜、酶钝化、蛋白质变性•醇类——溶解膜中的类脂，破坏膜结构，使蛋白变性（纯的或高浓度酒精使菌体表面蛋白凝固，使乙醇不易渗进细胞）•醛类——与蛋白质中氨基酸的多种基团共价结合而使其变性•酸类——抑制微生物酶和代谢活性•表面活性剂——改变细胞的稳定性和透性，细胞物质逸出•卤化物——与细胞中的酶和蛋白质中的酪氨酸结合，Cl2和漂白粉产生次氯酸和新生态氧（强氧化剂），破坏细胞膜结构6、化学药剂消毒或灭菌作用机理：•重金属——与酶或蛋白质上的—SH结合•氧化剂——使细胞成份氧化•染色剂——碱性染料的阳离子基团与蛋白质氨基酸上的羧基或核酸上的磷酸基结合，阻碍正常代谢•抗生素——多种机理：作用于细胞壁、膜、蛋白质、核酸等大分子合成•抗代谢物——竞争抑制，如磺胺类药物于对氨基苯甲酸类似，阻止叶酸的合成6、化学药剂消毒或灭菌作用机理：•墙壁光滑，地面平坦，避免积累灰尘，便于清洗消毒；不装风扇，通风换气通过空气调节装置使用前，用2%新洁尔敏擦洗再用75%酒精（或5%石炭酸）喷雾，使灰尘落下最后用紫外灯照射约20min定期熏蒸：一年二~四次（细菌、真菌培养基检验）用40%甲醛（6~10ml/m3)或加半量高锰酸钾熏蒸，盛于铁制容器，电炉或酒精灯加热（应能随时终止热源），熏蒸后密闭12h以上，使用前1~2h用氨水中和。其他熏蒸剂；乳酸（对细菌）、硫磺无菌室消毒升汞（0.1%HgCl2）漂白粉10g/150mlNaClO（2-10%）酒精75%苯酚（1%）福尔马林（5%）过氧化氢（3%）氰化汞（0.1%）高锰酸钾（2%）硝酸银(0.1%)常用表面消毒剂•酸性培养基:如10ml培养基中加三滴25%的乳酸•孟加拉红：0.035g/L培养基•抗菌素:金霉素（30μg/ml）可抑制多数细菌;青霉素（20μg/ml）可抑制G+细菌;多粘霉素（5.0μg/ml）可抑制G-细菌;链霉素(40μg/ml)和氯霉素(50μg/ml)可抑制大部细菌.除氯霉素可灭菌前加入外，其它抗菌素都是在培养基灭菌后并冷却到45℃左右时加入.•双层培养基或盖玻片细菌污染的排除抑制真菌：50~100u的放线菌酮或制霉菌素五、注意事项•牛肉膏、蛋白胨等的称取•淀粉、琼脂的融化•分装培养基不沾瓶/管口•调pH•标记•即时灭菌