GB 4789.29-2020 食品安全国家标准 食品微生物学检验 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞

书书书中华人民共和国国家标准犌犅４７８９．２９—２０２０食品安全国家标准食品微生物学检验唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）检验２０２００９１１发布２０２１０３１１实施中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局发布书书书犌犅４７８９．２９—２０２０Ⅰ　　　　前　　言本标准代替ＧＢ／Ｔ４７８９．２９—２００３《食品卫生微生物学检验　椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》。本标准与ＧＢ／Ｔ４７８９．２９—２００３相比，主要变化如下：———标准名称修改为“食品安全国家标准　食品微生物学检验　唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）检验”；———修改了范围；———修改了设备和材料；———修改了培养基和试剂；———修改了检验程序；———增加了结果报告；———增加了附录Ａ。犌犅４７８９．２９—２０２０１　　　　食品安全国家标准食品微生物学检验唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）检验１　范围本标准规定了食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）［犅狌狉犽犺狅犾犱犲狉犻犪犵犾犪犱犻狅犾犻（犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊犮狅犮狅狏犲狀犲狀犪狀狊ｓｕｂｓｐ．犳犪狉犻狀狅犳犲狉犿犲狀狋犪狀狊）］的检验方法。本标准适用于食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）的检验。２　设备和材料２．１　实验室常规灭菌设备。２．２　冰箱：２℃～８℃、－２０℃～－３０℃。２．３　恒温培养箱：２６℃±１℃、３６℃±１℃。２．４　恒温水浴锅：４６℃±１℃。２．５　显微镜：１０倍～１００倍。２．６　均质器。２．７　离心机：３０００ｒ／ｍｉｎ。２．８　电子天平：感量０．１ｇ。２．９　比浊计。２．１０　锥形瓶：容量１００ｍＬ、５００ｍＬ。２．１１　无菌培养皿：直径９０ｍｍ、直径１５０ｍｍ。２．１２　无菌透明玻璃纸、滤纸。２．１３　无菌灌胃器：１ｍＬ。２．１４　微生物生化鉴定系统。２．１５　小鼠：１８ｇ～２０ｇ，每一批次试验应使用同一品系的ＫＭ或ＩＣＲ小鼠。３　培养基和试剂３．１　ＧＶＣ增菌液：见Ａ．１。３．２　改良马铃薯葡萄糖琼脂（ｍＰＤＡ）：见Ａ．２。３．３　马铃薯葡萄糖琼脂（ＰＤＡ）：见Ａ．２．１。３．４　ＰＣＦＡ培养基：见Ａ．３。３．５　马铃薯葡萄糖半固体琼脂：见Ａ．４。３．６　卵黄琼脂：见Ａ．５。３．７　革兰氏染色液：见Ａ．６。３．８　氧化酶试剂：见Ａ．７。犌犅４７８９．２９—２０２０２　　　　３．９　ＨｕｇｈＬｅｉｆｓｏｎ培养基（Ｏ／Ｆ试验用）：见Ａ．８。３．１０　蛋白胨水（靛基质试验用）：见Ａ．９。３．１１　缓冲葡萄糖蛋白胨水（ＭＲ和ＶＰ试验用）：见Ａ．１０。３．１２　西蒙氏柠檬酸盐培养基：见Ａ．１３。３．１３　苯丙氨酸培养基：见Ａ．１４。３．１４　糖发酵管：见Ａ．１５。３．１５　半固体琼脂：见Ａ．１６。３．１６　抗Ｏ多价血清、型特异性因子血清（ＯⅢ、ＯⅣ、ＯⅤ、ＯⅥ、ＯⅦ、ＯⅧ）。３．１７　生化鉴定试剂盒。４　检验程序唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）检验程序见图１。图１　唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）检验程序犌犅４７８９．２９—２０２０３　　　　５　操作步骤５．１　样品处理无菌操作称取２５ｇ（ｍＬ）样品，置入盛有２２５ｍＬＧＶＣ增菌液的无菌均质袋中（鲜银耳样品取１ｇ，用剪刀剪碎，加入盛有２０ｍＬＧＶＣ增菌液的无菌均质袋中），用拍击式均质器拍打１ｍｉｎ～２ｍｉｎ；或置入盛有２２５ｍＬＧＶＣ增菌液的无菌均质杯中，以８０００ｒ／ｍｉｎ～１００００ｒ／ｍｉｎ均质１ｍｉｎ～２ｍｉｎ；若样品为液态，振荡混匀。５．２　增菌将上述样品增菌液置３６℃±１℃培养２０ｈ～２４ｈ。５．３　分离用直径３ｍｍ的接种环取增菌液一环，分别划线接种于ｍＰＤＡ平板和ＰＣＦＡ平板，３６℃±１℃培养２４ｈ～４８ｈ。观察各个平板上生长的菌落，各个平板上菌落特征见表１。表１　唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）在不同分离平板上的菌落特征培养基菌落特征ｍＰＤＡ平板培养２４ｈ后，菌落１ｍｍ～２ｍｍ，紫色，光滑、湿润、边缘整齐；培养４８ｈ后，部分菌落中心可有呈草帽状凸起ＰＣＦＡ平板培养２４ｈ后，菌落０．５ｍｍ～１ｍｍ，灰白色，光滑、湿润、边缘整齐卵黄琼脂平板培养２４ｈ后，菌落２ｍｍ～３ｍｍ，表面光滑、湿润；培养４８ｈ后，菌落周围形成乳白色混浊环，斜射光下可见菌落及周围培养基表面呈虹彩现象５．４　初筛试验自选择性琼脂平板上分别挑取５个以上典型或可疑菌落（低于５个全选），分区划线接种于卵黄琼脂平板，３６℃±１℃培养。挑取培养１８ｈ～２４ｈ的菌落进行革兰氏染色及氧化酶试验。对于革兰氏染色阴性、氧化酶试验阴性的菌继续培养至４８ｈ±２ｈ，对于卵磷脂酶阳性，带有虹彩环的单个菌落，接种ＰＤＡ平板，３６℃±１℃培养２４ｈ±２ｈ。５．５　生化试验从纯培养的ＰＤＡ平板上挑取菌苔进行生化鉴定。唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）生化特征见表２。可选择生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统。表２　唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）生化特征生化试验特　　征Ｏ／Ｆ试验（氧化型）＋氧化　　葡萄糖＋犌犅４７８９．２９—２０２０４　　　　表２（续）生化试验特　　征　　果糖＋　　木糖＋　　半乳糖＋　　蔗糖－　　阿拉伯糖＋　　甘露醇＋　　侧金盏花醇＋　　肌醇＋　　卫茅醇＋动力＋卵磷脂酶＋氧化酶－尿素＋明胶液化＋硝酸盐还原＋柠檬酸盐利用＋精氨酸＋石蕊牛乳＋靛基质－ＶＰ－ＭＲ－苯丙氨酸脱氨酶－Ｈ２Ｓ产生－　　注：＋表示阳性；－表示阴性。５．６　血清学分型（可选择项）５．６．１　菌体抗原的制备将ＰＤＡ平板３６℃±１℃培养２４ｈ±２ｈ的培养物用无菌生理盐水洗下，沸水浴（１００℃）２ｈ，３０００ｒ／ｍｉｎ　１０ｍｉｎ离心弃上清液，再用无菌生理盐水稀释至５×１０８ＣＦＵ／ｍＬ～１×１０９ＣＦＵ／ｍＬ菌悬液，作为凝集试验用抗原。５．６．２　菌体抗原的鉴定用多价血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。与多价血清凝集者，依次用ＯⅢ、ＯⅣ、ＯⅤ、ＯⅥ、ＯⅦ、ＯⅧ因子血清做试管凝集试验。根据试验结果，判定菌体抗原型。在生理盐水中自凝者不能分型。生化特征符合，但不能与以上血清凝集者，需保留菌株做进一步鉴定。犌犅４７８９．２９—２０２０５　　　　５．７　毒性试验５．７．１　产毒培养将初步鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）的菌株接种ＰＤＡ平板，３６℃±１℃，培养２４ｈ±２ｈ，用灭菌接种环刮取适量菌苔，加到３ｍＬ无菌生理盐水的试管中，配成１麦氏浓度（ＭｃＦａｒｌａｎｄ，ＭＣＦ）的菌悬液（约为１０８ＣＦＵ／ｍＬ），用无菌吸管吸取０．５ｍＬ，滴在铺好无菌玻璃纸的直径１５０ｍｍ马铃薯葡萄糖半固体平板上，用无菌Ｌ棒涂布均匀，２６℃±１℃培养５ｄ。取下带菌的玻璃纸，将半固体平板置于１００℃流动蒸汽灭菌３０ｍｉｎ。室温冷却后，置－２０℃～－３０℃冰箱过夜。将冰冻好的半固体平板置室温融化，用无菌吸管吸出冻融液，经滤纸过滤至无菌试管或锥形瓶中（此为毒素粗提液），４℃避光保存。同时，将未接种菌苔、铺好无菌玻璃纸的直径１５０ｍｍ马铃薯葡萄糖半固体平板作为阴性对照，按照同样的试验方法制备阴性对照粗提液，４℃避光保存。５．７．２　毒力测定取毒素粗提液或经１００℃水浴蒸发后的５倍～１０倍浓缩液，灌胃小鼠３只，每只０．５ｍＬ，观察至７ｄ。若菌株产生米酵菌酸，小鼠在灌胃后２０ｍｉｎ～２４ｈ内发病。主要症状为竖毛、萎糜不振、躁动，继而行步蹒跚、肢体麻痹、瘫软、抽搐，呈角弓反张状，呼吸急促、死亡。取阴性对照粗提液或经１００℃水浴蒸发后的５倍～１０倍浓缩液，灌胃小鼠３只，每只０．５ｍＬ，观察至７ｄ。小鼠应健康存活。５．７．３　米酵菌酸测定毒力测定实验阳性时，分别取毒素粗提液，阴性对照粗提液，按照ＧＢ５００９．１８９执行。６　结果报告生化试验符合且毒性试验阳性，报告检出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）；生化试验和毒性试验有一项不符合，报告未检出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）。犌犅４７８９．２９—２０２０６　　　　附　录　犃培养基和试剂犃．１　犌犞犆增菌液犃．１．１　马铃薯葡萄糖水（犘犇水）犃．１．１．１　成分马铃薯（去皮）　　　　　　　　３００ｇ葡萄糖２０ｇ蒸馏水１０００ｍＬｐＨ７．０±０．２犃．１．１．２　制法称取３００ｇ去皮马铃薯，切碎块，加１０００ｍＬ蒸馏水，煮沸１０ｍｉｎ～２０ｍｉｎ。用纱布过滤，补加蒸馏水至１０００ｍＬ。加入葡萄糖，加热溶化，分装，１２１℃高压２０ｍｉｎ。犃．１．２　龙胆紫水溶液犃．１．２．１　成分龙胆紫０．１ｇ蒸馏水１００ｍＬ犃．１．２．２　制法取０．１ｇ龙胆紫，用少量蒸馏水溶解后，加蒸馏水，稀释到１００ｍＬ，保存在棕色瓶内。使用前过滤除菌。犃．１．３　氯霉素溶液犃．１．３．１　成分氯霉素２０．０ｍｇ蒸馏水１０ｍＬ犃．１．３．２　制法２０．０ｍｇ氯霉素溶解于１０．０ｍＬ蒸馏水，过滤除菌。犃．１．４　犌犞犆增菌液每１００ｍＬＰＤ水中加入龙胆紫水溶液１．０ｍＬ、氯霉素溶液１．０ｍＬ，混匀，分装后置于４℃备用。混合液中龙胆紫和氯霉素的终浓度分别为１０μｇ／ｍＬ和２０μｇ／ｍＬ。犌犅４７８９．２９—２０２０７　　　　犃．２　改良马铃薯葡萄糖琼脂（犕狅犱犻犳犻犲犱犘狅狋犪狋狅犇犲狓狋狉狅狊犲犃犵犪狉，犿犘犇犃）犃．２．１　马铃薯葡萄糖琼脂（犘犇犃）犃．２．１．１　成分马铃薯（去皮）３００ｇ葡萄糖２０ｇ琼脂１５ｇ蒸馏水１０００ｍＬｐＨ７．０犃．２．１．２　制法称取３００ｇ去皮马铃薯，切碎块，加１０００ｍＬ蒸馏水，煮沸１０ｍｉｎ～２０ｍｉｎ。用纱布过滤，补加蒸馏水至１０００ｍＬ。加入葡萄糖和琼脂，加热溶化，分装，１２１℃高压灭菌２０ｍｉｎ。犃．２．２　龙胆紫水溶液犃．２．２．１　成分龙胆紫０．１ｇ蒸馏水１００ｍＬ犃．２．２．２　制法取０．１ｇ龙胆紫，用少量蒸馏水溶解后，加蒸馏水，稀释到１００ｍＬ，保存在棕色瓶内。使用前过滤除菌。犃．２．３　氯霉素溶液犃．２．３．１　成分氯霉素２０．０ｍｇ蒸馏水１０ｍＬ犃．２．３．２　制法２０．０ｍｇ氯霉素溶解于１０．０ｍＬ蒸馏水，过滤除菌。犃．２．４　改良马铃薯葡萄糖琼脂（犿犘犇犃）临用时加热溶解ＰＤＡ琼脂，冷却至５０℃，每１００ｍＬＰＤＡ中加入龙胆紫水溶液１．０ｍＬ、氯霉素溶液１．０ｍＬ，混匀后倾注平板。龙胆紫和氯霉素的终浓度分别为１０μｇ／ｍＬ和２０μｇ／ｍＬ。犃．３　犘犆犉犃培养基犃．３．１　成分ＮＨ４Ｃｌ１ｇＫＨ２ＰＯ４１．１４ｇ犌犅４７８９．２９—２０２０８　　　　Ｎａ２ＨＰＯ４０．７ｇＮａＣｌ４ｇＣａＣｌ２０．００５ｇＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．２ｇＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．０００５ｇ胱氨酸０．０１ｇ葡萄糖０．０５ｇ卫茅醇１５ｇ琼脂粉１２ｇ蒸馏水１０００ｍＬｐＨ７．０±０．２犃．３．２　犘犆犉犃基础培养基制法将上述成分加热溶解后，调节ｐＨ，１１５℃高压灭菌１５ｍｉｎ，备用。犃．３．３　选择性添加剂硫酸多黏菌素Ｂ：５００００Ｕ林肯霉素：３００００Ｕ犃．３．４　制法将ＰＣＦＡ基础培养基加热融化冷却至５０℃后，加入选择性添加剂，混匀后倾注无菌平皿中，备用。犃．４　马铃薯葡萄糖半固体琼脂犃．４．１　成分马铃薯（去皮）３００ｇ葡萄糖２０ｇ琼脂５ｇ蒸馏水１０００ｍＬｐＨ７．０±０．２犃．４．２　制法称取３００ｇ去皮马铃薯，切碎块，加１０００ｍＬ蒸馏水，煮沸１０ｍｉｎ～２０ｍｉｎ。用纱布过滤，补加蒸馏水至１０００ｍＬ。加入葡萄糖和琼脂，加热溶化，分装，１２１℃高压２０ｍｉｎ。犃．５　卵黄琼脂犃．５．１　基础培养基成分肉浸液１０００ｍＬ蛋白胨１５ｇ氯化钠５ｇ琼脂２５ｇ～３０ｇ犌犅４７８９．２９—２０２０９　　　　ｐＨ７．０±０．２犃．５．２　５０％卵黄盐水悬液犃．５．３　卵黄琼脂的制备制备基础培养基，分装每瓶１００ｍＬ。１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。临用时加热溶化琼脂，冷至５０℃，每瓶内加入５０％葡萄糖水溶液２ｍＬ和５０％卵黄盐水悬液１０ｍＬ～１５ｍＬ，摇匀，倾注平板。犃．６　革兰