GB∕T 37874-2019 核酸提取纯化方法评价通则

书书书犐犆犛０７．０８０犌００!#$%&’’()*犌犅／犜３７８７４—２０１９!#$%&’()*+,犌犲狀犲狉犪犾狉狌犾犲狊犳狅狉犲狏犪犾狌犪狋犻狅狀狅犳狀狌犮犾犲犻犮犪犮犻犱犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀犪狀犱狆狌狉犻犳犻犮犪狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱狊２０１９０８３０-.２０１９０８３０/0’(+,-./012!’’()*3/0456-.书书书目　　次前言Ⅲ…………………………………………………………………………………………………………１　范围１………………………………………………………………………………………………………２　规范性引用文件１…………………………………………………………………………………………３　术语和定义、缩略语１………………………………………………………………………………………４　基本要求２…………………………………………………………………………………………………５　指标参数２…………………………………………………………………………………………………６　评价方法３…………………………………………………………………………………………………Ⅰ犌犅／犜３７８７４—２０１９前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家标准物质研究中心提出并归口。本标准起草单位：中国科学院北京基因组研究所、中国计量科学研究院。本标准主要起草人：孟庆姝、傅博强、胡松年、葛晓萌、谈昕煜、牛春艳、毕小春。Ⅲ犌犅／犜３７８７４—２０１９核酸提取纯化方法评价通则１　范围本标准规定了核酸提取纯化方法评价的指标参数和评价方法。本标准适用于分子生物学实验室对于常规样本（新鲜样本）的核酸（基因组ＤＮＡ与总ＲＮＡ）提取纯化方法的一般性评价。本标准不适用于病毒核酸的提取，游离ＤＮＡ的提取，陈旧样本、微量样本与高度降解样本核酸的提取方法的评价，也不适用于在提取过程中通过添加外源ＤＮＡ或ＲＮＡ以提高提取效率的核酸提取方法的评价。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单）适用于本文件。ＩＳＯ８６５５２：２００２　活塞式容量测量器　第２部分：活塞移液器（Ｐｉｓｔｏｎｏｐｅｒａｔｅｄｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃａｐｐａｒａｔｕｓ—Ｐａｒｔ２：Ｐｉｓｔｏｎｐｉｐｅｔｔｅｓ）３　术语和定义、缩略语３．１　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１．１核酸　狀狌犮犾犲犻犮犪犮犻犱由核苷酸或脱氧核苷酸通过３′，５′磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。具有非常重要的生物功能，主要是贮存遗传信息和传递遗传信息。包括核糖核酸（ＲＮＡ）和脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）两类。［ＪＪＦ１２６５—２０１０，定义４．４２］３．１．２标准物质　狉犲犳犲狉犲狀犮犲犿犪狋犲狉犻犪犾具有足够均匀和稳定的特定特性的物质，其特性被证实适用于测量中或标称特性检查中的预期用途。［ＪＪＦ１００１—２０１１，定义８．１４］３．２　缩略语下列缩略语适用于本文件。ＤＮＡ：脱氧核糖核酸（ＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ）ＥＤＴＡ：乙二胺四乙酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）ＯＤ：光密度（ＯｐｔｉｃａｌＤｅｎｓｉｔｙ）１犌犅／犜３７８７４—２０１９ＲＮＡ：核糖核酸（ＲｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ）ＴＥ：三羟甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸（ＴｒｉｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅＥｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）Ｔｒｉｓ：三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）４　基本要求常规的用于分子生物学提取核酸的样本主要包括新鲜的动植物组织样本、细胞样本、血液样本、唾液样本和粪便样本等。宜选用新鲜样本进行核酸提取；若不能马上提取，应分装成小份，按照样本特性与采集情况妥善保存。５　指标参数５．１　核酸完整度５．１．１　一般说明核酸完整度表征提取过程中保持核酸一级结构（序列）完整而不发生改变的程度。在核酸提取时应尽量防止物理（剪切力、高温）、化学因素（强酸、强碱）和生物因素（核酸酶）的破坏。根据试验条件和核酸样品，可以选择琼脂糖凝胶电泳方法进行核酸完整度测定，根据条带位置和不同条带的荧光亮度分析综合计算评价核酸的完整性。５．１．２　犇犖犃完整度用琼脂糖凝胶电泳法检测，完整基因组ＤＮＡ电泳结果为一条清晰明亮的条带，条带拖尾或者弥散代表ＤＮＡ有部分降解。５．１．３　总犚犖犃完整度５．１．３．１　真核生物总犚犖犃完整度用琼脂糖凝胶电泳法检测，真核生物完整的总ＲＮＡ电泳结果为清晰的两条条带２８Ｓ和１８Ｓ核糖体ＲＮＡ条带。２８Ｓ和１８Ｓ核糖体ＲＮＡ条带清晰，且两条条带的荧光亮度比值（２８Ｓ∶１８Ｓ）＞１，以满足后续试验的要求。５．１．３．２　原核生物总犚犖犃完整度用琼脂糖凝胶电泳法检测，原核生物完整的总ＲＮＡ电泳结果为清晰的两条条带２３Ｓ和１６Ｓ核糖体ＲＮＡ条带。２３Ｓ和１６Ｓ核糖体ＲＮＡ条带清晰，且两条条带的荧光亮度比值（２３Ｓ∶１６Ｓ）＞１，该完整度可以满足绝大部分后续试验的要求。５．１．３．３　总犚犖犃降解用琼脂糖凝胶电泳法检测，如果电泳条带弥散，没有清晰的核糖体ＲＮＡ条带，为部分降解的ＲＮＡ样品；电泳条带呈现极低分子质量处的弥散状，为完全降解的ＲＮＡ样品。５．２　提取产量提取产量是指单位样本中提取得到的核酸（ＤＮＡ或ＲＮＡ）的总质量。该指标用于表征提取得率。２犌犅／犜３７８７４—２０１９采用微量紫外测定仪和／或微量荧光剂测定提取液中的核酸质量浓度（ｎｇ／μＬ），结合提取液体积计算提取量，计算得率。计算公式与参考得率见６．２．３。５．３　核酸纯度５．３．１　一般说明核酸纯度是指核酸提取物中目标核酸的纯度，该指标用于表征核酸提取物中目标核酸与残留杂质的相对含量，对于后续的分子生物学试验有重要的影响。核酸在特定波长的吸光度值及其在不同波长吸光度值的比率对不同性质的核酸有对应的特征值，用以表征提取液的核酸纯度。用紫外分光光度计测定２６０ｎｍ、２８０ｎｍ、２３０ｎｍ下提取液的吸光度ＯＤ２６０、ＯＤ２８０、ＯＤ２３０，计算ＯＤ２６０／ＯＤ２８０和ＯＤ２６０／ＯＤ２３０，表征核酸纯度。测量吸光度时，需调整核酸浓度，保证核酸吸光值ＯＤ２６０在０．１～１．５之间。５．３．２　犇犖犃纯度纯ＤＮＡＯＤ２６０／ＯＤ２８０为１．８，在ＤＮＡ提取获得的产物中，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０在１．７～１．９表明ＤＮＡ纯度符合后续一般分子生物学试验需要。ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＞１．９时表明有ＲＮＡ污染；ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＜１．７时表明有蛋白质、多酚等污染。纯ＤＮＡＯＤ２６０／ＯＤ２３０＞２．０。ＯＤ２６０／ＯＤ２３０＜２．０，表明有残存的盐或其他小分子杂质。５．３．３　犚犖犃纯度纯ＲＮＡ的ＯＤ２６０／ＯＤ２８０为２．０，ＲＮＡ提取溶液的ＯＤ２６０／ＯＤ２８０在１．７～２．０表明ＲＮＡ纯度基本可以满足后续分子生物学试验处理需要。ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＜１．７时表明有蛋白质或多酚污染；ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＞２．０时表明可能有异硫氰酸残存。纯ＲＮＡ的ＯＤ２６０／ＯＤ２３０＞２．０。ＯＤ２６０／ＯＤ２３０＜２．０，表明有残存的盐或其他小分子杂质。６　评价方法６．１　琼脂糖凝胶电泳法评价核酸完整度６．１．１　仪器和设备６．１．１．１　水平电泳仪。６．１．１．２　凝胶成像系统：像素不低于１３０万。６．１．１．３　微量移液器：应符合ＩＳＯ８６５５２：２００２的要求。６．１．２　操作步骤配制与核酸类型及电泳仪规格相匹配的琼脂糖凝胶；取合适浓度的核酸样品溶液与核酸上样缓冲液混合；电泳至合适位置；用凝胶成像系统观察核酸条带。６．２　荧光定量法评价核酸提取产量６．２．１　试剂和溶液荧光定量试剂盒。３犌犅／犜３７８７４—２０１９６．２．２　仪器和设备６．２．２．１　荧光定量仪灵敏度应达到１０ｐｇ／μＬ。６．２．２．２　微量移液器应符合ＩＳＯ８６５５２：２００２的要求。６．２．３　操作步骤首先根据样品选择适当的标准物质校准荧光定量仪。标准物质在使用前需要现用现配（稀释），标准物质与荧光染料充分混合后需孵育适当的时间（按仪器使用指南操作）。检测时取待测核酸提取纯化样品与荧光染料混合均匀，室温孵化后检测荧光，回归曲线分析得到检测结果。为保证结果的准确性，每个样品应重复检测三次，从与荧光染料的混合开始。然后根据式（１）计算核酸提取纯化产物产量。犙＝∑狀犻＝１ρ犻狀×犞…………………………（１）　　式中：犙———产量，单位为纳克（ｎｇ）；ρ犻———第犻次荧光定量仪测得的核酸质量浓度，单位为纳克每微升（ｎｇ／μＬ）；狀———测量重复次数；犞———核酸溶液的体积，单位为微升（μＬ）。６．２．４　经验参考值对于几种常见的生物样本，合格的核酸提取纯化方法的参考得率（最低标准）为：起始样品为１００μＬ全血时，提取到的基因组ＤＮＡ产量≥１μｇ，总ＲＮＡ产量≥５００ｎｇ；起始样品为１×１０６细胞时，提取到的基因组ＤＮＡ产量≥１μｇ，总ＲＮＡ产量≥５００ｎｇ；起始样品为１００ｍｇ新鲜植物叶片时，提取到的基因组ＤＮＡ产量≥１μｇ，总ＲＮＡ产量≥５００ｎｇ。６．３　紫外吸光法评价核酸纯度６．３．１　试剂和溶液核酸样品溶解液。６．３．２　仪器和设备６．３．２．１　紫外分光光度仪：ａ）　波长范围：１９０ｎｍ～１１００ｎｍ；ｂ）　波长准确度：±０．１ｎｍ；ｃ）　波长重复性：±０．１ｎｍ。４犌犅／犜３７８７４—２０１９６．３．２．２　微量移液器：应符合ＩＳＯ８６５５２：２００２的要求。６．３．３　操作步骤抬起仪器检测臂，加２μＬ蒸馏水清洁上下基座；吸取１μＬ核酸样品溶解液作为空白对照，检测空白对照；吸取１μＬ核酸样品测定样品溶液在２６０ｎｍ、２８０ｎｍ、２３０ｎｍ处的吸收值，计算ＯＤ２６０／ＯＤ２８０、ＯＤ２６０／ＯＤ２３０的比值。每个样品重复测定３次，计算求得平均比值。犌犅／犜３７８７４—２０１９