单抗系列培训完整版PPT

单克隆抗体分享人：李行2017.08单抗基本概念单抗发展历程单抗制备原理单抗实际应用实验存在的问题报告内容单抗简介单抗简介1975年Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，使经绵羊红细胞（SRBC）免疫的小鼠脾细胞和小鼠的骨髓瘤细胞融合，创立了第一个B细胞杂交瘤细胞株，获得了抗SRBC的单克隆抗体。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。因此说单抗技术是免疫学，乃至医学史上的一个里程碑。抗体生产技术的三个时代：多克隆抗体单克隆抗体基因工程抗体基本概念1.抗原1.1传统抗原基本概念：能启动机体的免疫应答，且能与其免疫应答产物(抗体或免疫效应细胞)特异性结合，并产生一系列生物学效应的物质。1.2现代抗原概念：能被B细胞免疫球蛋白受体识别或与主要组织相容性复合体（MHC）结合后能被T细胞受体识别的物质统称为抗原。1.3抗原的两种基本特性：（1）免疫原性：指抗原分子能够刺激机体产生免疫应答（产生特异性抗体及免疫效应细胞）的性质。（2）反应原性：指抗原分子与免疫应答产物（抗体或免疫效应细胞）发生特异性结合的性质。1.4完全抗原与半抗原（1）完全抗原：具有免疫原性和反应原性的物质。（2）半抗原又称不完全抗原：无免疫原性，只有抗原性的物质。（3）载体（carrier）：与半抗原结合使其成为免疫原的物质。如BSA，OVA半抗原+载体􀃆完全抗原1.5抗原表位（抗原决定簇）：指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。即抗原上可以引起机体产生抗体的分子结构。一个抗原可以有许多不同的抗原决定簇。抗体（Antibody,Ab）基本概念：机体免疫细胞被抗原激活后，由分化成熟的终末B细胞-浆细胞合成、分泌的一类能与抗原特异性结合的具有免疫功能的免疫球蛋白。3.免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）：具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。2.抗体备注：Ab=Ig,Ig≠Ab,Ab是功能描述，Ig是化学结构的描述。基本结构：重链（heavychain，H）2条轻链（lightchain，L）2条可变区（variableregion,V区）恒定区（constantregion,C区）超变区（hyper-variableregion,HVR),又称互补决定区（complementarydeterminingregion,CDR）骨架区（frameworkregion,FR）铰链区（hingeregion）3.1免疫球蛋白的结构•可变区Ig的两条长链称为重链（Heavychain，H链），重链可分为：μγαδε，对应的Ig的种类：IgM,IgG,IgA,IgD,IgE.Ig的两条短链称为轻链，可分为κ，λ；每个Ig分子的两条轻链完全相同。4.多克隆抗体（polyclonalantibody,PcAb）：指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。如：免疫血清（含多种特异性抗体）。5.单克隆抗体（monoclonalantibody，McAb）：是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗体。6.细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞群体。克隆能够保持亲本的绝大部分性状。8.多克隆抗体和单克隆抗体的优劣势PcAbMcAb特异性低高均一性无有敏感性差强亲和力亲和力较强亲和力不强成本、时间制备相对便宜，时间短成本高，时间长杂交瘤技术基本原理制备流程融合在具有筛选作用的培养基中培养筛选出分泌抗体的细胞，进行克隆化SP2/0B细胞和SP2/0死亡1.抗原制备不管是制备单抗还是多抗，抗原的设计与制备都是一个非常重要的问题，设计或者制备得不好的抗原有可能完全不能免疫出抗体来。1.1一个良好的抗原必须具备的条件：（1）分子量：一般是分子量越大，免疫原性越强，对于多肽或蛋白质类的抗原来说，一个抗原决定簇（又叫表位，epitope），通常由6-8个氨基酸残基组成。而平均每5-10kD才有一个表位，因此分子太小的多肽或蛋白是很难有一个表位的。抗体制备过程及影响因素（2）化学结构与组成：结构尽量复杂。简单重复的物质是不具有免疫原性的，拿明胶来说，它的分子量非常大，而且外源性也很强，但是组成明胶的氨基酸多为直链氨基酸，在体内容易被降解，因此它的免疫原性很弱。蛋白质：a.氨基酸组成：含芳香族氨基酸（特别是酪氨酸），免疫源性强。b.结构：环状的免疫原性强；直链，免疫原性弱。多糖：具有免疫原性，较蛋白质弱。核酸：多无免疫原性。（3）外源性强。在个体形成的早期就对自身物质形成了免疫耐受，因此如果和机体内的物质完全一样或者是相似就很难引起机体的免疫应答。（4）可降解性好。作为抗原，必须是可以降解的，塑料、不锈钢等难降解的物质免疫原也很弱。含L-氨基酸的蛋白质易降解，具有免疫原性。但是由D-型氨基酸组成的物质免疫原性很弱，同样是因为机体不能降解D-氨基酸组成的蛋白或多肽。2.免疫方案2.1动物的选择：常见的可以用来制备抗体的动物有：小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、绵羊、山羊、马、驴、奶牛，还有用鸡或者鸭的。需考虑的问题：a.第一个问题是能否具有较好的免疫效果.b.第二个问题是抗血清产量的问题.2.2免疫佐剂：先于免疫原或同时与抗原混合注射机体可增强抗原的免疫原性的物质。（1）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果，如细胞类抗原、电泳跑蛋白胶。（2）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂。a.油性佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂；b.无机化合物c.微生物及其产物d.脂质体e.细胞因子2.4抗原与佐剂的乳化2.5免疫途径：（1）体内免疫：皮下，腹腔，肌肉，静脉等（2）体外免疫：较少。2.3免疫剂量：根据免疫原、免疫途径、免疫动物、免疫佐剂有关。一般的免疫剂量是微克级别。2.6免疫时间间隔：一般间隔2-3个星期。抗体产生的一般规律初次应答：抗原初次进入机体产生的应答。特点：潜伏期（诱导期）长（7-10天）；抗体的种类以IgM为主；抗体的亲和力低；维持时间短；总抗体水平低。再次应答：抗原再次进入机体所产生的应答。特点：潜伏期短（约2-3天）；抗体的种类以IgG为主；抗体的亲和力比初期应答明显增强；维持时间长；总抗体水平高。3.免疫鼠血清的采集和检测小鼠第三次免疫1周后，免疫组对小鼠进行眼球静脉采血，收集血清，血清交由检测负责人，该负责人对血清进行检测。（1）免疫酶技术：ELISA，IPMA（2）免疫荧光技术：IFA（3）间接血凝实验（4）放射免疫检测4.杂交瘤细胞株的建立√SP2/0的准备√饲养层细胞的制备√脾细胞（B细胞）的制备脾细胞和SP2/0的融合单克隆抗体的制备与鉴定杂交瘤的筛选√细胞的冻存和复苏√√实验关键！！！4.1试剂和耗材4.1.1试剂：DMEM、胎牛血清（FBS）、HAT、HT、50%PEG，青、链霉素、生理盐水;4.1.2仪器：生物安全柜、二氧化碳培养箱、水平离心机、倒置显微镜；工具：止血钳，剪刀、直头眼科镊子、弯头眼科镊子4.2进行细胞融合的前一天，准备饲养层细胞：(1)8-10周龄BALB/c雌性小鼠;(2)用注射器向腹腔内注射DMEM，轻轻揉压小鼠腹膜，抽出腹腔内液体，收集到一个离心管中，反复操作3次左右;(3)离心1000rpm,5min,弃上清，重悬细胞，铺板密度2x105。实验流程4.2.2准备饲养层细胞:取静止状态的腹腔巨噬细胞4.2.1骨髓瘤细胞SP2/0的培养：对数生长期4.2.3脾细胞（B细胞）的制备：融合前3天加强免疫小鼠（1）注射器反复吹打法（2）研磨法（1）生物方法：病毒诱导的细胞融合（2）化学诱导：PEG诱导50%PEG(1000~4000)（3）物理诱导：电融合4.2.4脾细胞和SP2/0的融合：融合方法主要有以下几种方法细胞融合融合过程中的注意事项：（1）SP2/0细胞和免疫脾细胞的数量比例适当，1:5-1:10；（2）两种细胞状态要好，洗吹细胞一定要轻柔；（3）PEG融合之后，加培养基中和时要缓慢，以免破坏融合的细胞。杂交瘤细胞的筛选（第一次筛选）5、阳性杂交瘤细胞的筛选（第二次筛选）：筛选时机的把握（1）免疫酶技术：ELISA应用最多。（2）免疫荧光技术：IFA（3）间接血凝实验（4）放射免疫检测（5）免疫印迹分析（6）免疫沉淀（7）免疫组化和功能中和试验重要思考：“你的抗体用于什么就用什么去筛”，筛选策略必须能够反映所需抗体随后的用途。选择筛选策略时，必须要考虑下面的因素：（1）能够处理多达1000个样品（约120ul/样品）的能力；（2）48h内能够完成鉴定的能力；（3）是否具备必要的试剂/设备；（4）反应的特异性；（5）实验体系的灵敏度；（6）最重要的是否能得到结果。筛选时融合前的免疫血清作为阳性对照，这样确保所有的技术、试剂、设备是最合适的。同样，用培养杂交瘤细胞的培养基作为阴性对照。6、杂交瘤细胞的克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。6.1克隆化的原则：尽早进行，一般要进行2-3次克隆。6.3克隆化的方法主要包括以下：克隆之前制备饲养细胞6.2（1）有限稀释法:其原理是，将培养孔内细胞用枪或吸管吹打使之悬浮，然后用计数板进行计数，最后按每孔0.5-1个细胞的量将原孔细胞稀释滴至新的培养板上（事先制备好饲养层细胞），培养一段时间以后就可以看到部分孔有单个克隆形成（理论上讲最终每孔的细胞个数在整体上服从泊松分布）优点:a、最简单的克隆化方法；b、不需要太多的仪器设备，操作也不复杂。缺点：a、由于计数不准确或者移液器的偏差，最终导致操作结果不理想；b、由于细胞经过吹打的剪切力破坏，细胞也不一定能够按期望生长。（2）半固体培养法:原理和做分子克隆时的菌落筛选有点类似半固体培养原理和做分子克隆时的菌落筛选有点类似;其方法是将杂交瘤细胞与液体低融点的琼脂糖或甲基化纤维素溶液混合，然后将其倒入含有事先制备的饲养层的培养板上，冷后后培养基呈固态，在37℃培养一段时间后，单个杂交瘤细胞会形成类似菌落的小克隆，可以用枪头将其挑出到培养板上在液体培养基里培养，这样也可以实现克隆化。优点：a、操作比较直观简单，缺点：对半固体培养基的要求比较高，容易出现细胞不生长或者污染情况发生。（3）显微操作法把阳性孔里的细胞稀释到足够稀，静置半小时后细胞会沉淀到孔底，然后在显微镜下用枪直接吸取一个单细胞转移到含有饲养层细胞的孔内培养即可。优点：最初级、最直观、最省脑力和人力的办法，步骤简单。（4）荧光激活细胞分离法：流式细胞术7.细胞的冻存和复苏及时对各阶段阳性杂交瘤细胞进行冻存冻存步骤：（1）吹下需冻存的细胞；（2）1000rpm离心5min，弃上清；（3）用冻存液将细胞重悬，之后冻存；（4）将细胞放入细胞冻存盒内，然后将其直接放入-80℃冰箱过夜（不小于12h），之后将细胞转入液氮中。细胞复苏步骤：（1）从液氮中取出细胞，迅速置于37℃水浴锅中融化细胞；-----快！！！（2）直接将细胞加入瓶（25cm2）中，并加入含20%胎牛血清的DMEM培养基贴壁培养,12小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。8.单克隆抗体的生产8.1在产生特异性抗体的杂交瘤细胞分离、克隆并冻存建库后，扩增杂交瘤细胞可以生产抗体。处于对数生长期的杂交瘤细胞培养上清可产生3-20ug/ml的抗体。----抗体产量低8.2目前单克隆抗体生产包括腹水制备和细胞培养两种方法。8.2.1腹水制备流程：（1）提前7天，小鼠腹腔注射0.5ml石蜡油；（2）小心吹打细胞瓶底部，使细胞从瓶底脱落，收集细胞；（3）室温1200r/min离心6min，弃上清；（4）用不完全培养液DMEM或生理盐水按照0.5ml/只鼠悬浮细胞；（5）将细胞悬液注射到小鼠腹腔；（6）7-10天后小鼠腹腔明显鼓起后，采集腹水。8.2.2细胞培养生产单抗：利用滚瓶、转瓶和CELLine瓶制备单抗。（1）在单克隆抗体的产量方面，滚瓶和转瓶较一般的细胞培养瓶只有少许优势。（2）CELLi