流式原理培训

流式细胞术---理论及应用主要内容流式细胞术简介流式细胞术应用•细胞周期检测•细胞凋亡检测流式细胞仪预约使用规范附二院分析型流式细胞仪BDCantoII二激光六色(自动上样，同时容纳40个样本)488nm蓝激光633nm红激光BeckmenCytoflex双激光六色（单上样管，半自动上样）488nm蓝激光635nm红激光流式细胞仪基本构造•液流系统–流动室–液流驱动系统•光学系统–激发光源–光束收集系统•电子系统–光电转换器–数据处理系统荧光信号电信号数字信号流式细胞术:用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。流式细胞术（FlowCytometry,FCM）进样孔光信号激光束鞘液Sheath流式细胞术光信号类型•散射光信号：与标记荧光素无关，是细胞的固有参数。–前向散射光(forwardscatter,FSC);–侧向散射光(sidescatter,SSC)•荧光信号–自发荧光：微弱–特异荧光：标记的荧光素分子发出的荧光，比自发荧光强很多倍。散射光信号FSC和SSC当颗粒通过聚焦光束时，激光向各个方向散射。与激光束方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。与激光束垂直的称侧向角散射光信号（SSC）。FSC：反应细胞大小和活力SSC：反应细胞内部颗粒度和精细结构变化FSC/SSC的作用实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。荧光信号当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束时，燃料吸收光子跃迁到高能级，返回基态时，染料释放出能量，以光的形式释放。这种发出的光成为荧光。荧光通道–散射光通道:FSC和SSC通道；–荧光通道•通道命名方式：–以FL(fluorescence)加数字命名，如FL1、FL2、FL3等。–以该通道接收的主要荧光素命名，如FITC通道、PE通道、APC通道等。FL的作用荧光素分子激发光波长（nm）发射光波长（nm）中文名FITC490520异硫氰酸荧光素PE488575藻红蛋白PerCP490675多甲藻叶绿素蛋白APC650660别藻青蛋白PE-Cy5496/546670藻红蛋白-花青素5PE-Cy7496/546767藻红蛋白-花青素7AlexaFlour488495519AlexaFlour647650665常用荧光染料499nm蓝色荧光（Blue）；500-549nm，绿色荧光（Green）；550-584nm，黄色荧光（Yellow）585-615nm，橙色荧光（Orange）；616-700nm，红色荧光（Red）；≥700nm，远红外荧光（Far-Red）。荧光抗体的选择根据流式细胞仪选择抗体根据抗原表达强弱合理选择抗体•不同荧光素强度有所不同•高表达的抗原可不用太“亮”的荧光染料，“亮”的荧光染料分配给表达低的抗原选择荧光波谱见光谱重叠小的染料进行组合，同时正确的调节补偿(细胞携带两种以上荧光素激发出不同波长荧光时，理论上可选择滤光片使每种荧光仅被相应的通道检测。由于目前使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，因而少量的荧光信号会被另一通道检测到，这种现象就是光谱重叠.)对照的设置空白对照•设置空白对照（未染色的细胞），用以区分细胞的自发荧光和特异性荧光，避免假阳性的结果。•流式结果中荧光强弱是一个相对值，光电倍增管电压越信号越强。通过调节电压，使阴性对照管的荧光强度处于阴性的位置，实验组的荧光值都是相对对照组。同型对照•非特异性染色–抗体的Fc段可以与细胞表面的Fc受体非特异性结合；–抗体进入胞内，不容易洗脱，造成非特异性染色。–实验抗体：FITC-CD3单克隆抗体为鼠IgG1亚型抗体;–同型对照：相同剂量未免疫小鼠血清纯化的IgG1，并标记FITC。单标对照•两色或多色实验时须设置单标对照，用于补偿的调节(以PE/FITC为例)；•单标实验时不需要。FL-1(FITC)FL-2(PE)FL-1(FITC)FL-2(PE)FL2-%FL1FL-1(FITC)FL-2(-)FL-1(-)FL-2(PE)FL1-%FL2补偿前补偿后FITC单标PE单标流式数据显示:单参数直方图(Histogram)双参数数据显示--散点图(DotPlot)--等高线图(ContourPlot)--密度图（DensityPlot）三维图(3DPlot)直方图(Histogram):横坐标是散射光或荧光相对强弱，纵坐标代表细胞数散点图：每一个点代表一个细胞，横纵轴各代表一个参数等高线图：同一条线上的细胞数目相等，越靠里的曲线说明细胞数目越多密度图：点密度越大的地方，细胞数越多三维图FSC/SSC/FL荧光抗体选择原则对照设置（荧光补偿）流式数据显示小结流式细胞术应用----细胞周期细胞周期：细胞从一次分裂完成到下一次细胞分裂结束所经历的全过程，分为间期和分裂期两个阶段周期检测的原理周期检测步骤0.25%胰酶（无EDTA）消化，将细胞消化成单个。离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。打孔：加入1ml预冷（-20度）70%乙醇到细胞沉淀中，于4度固定过夜（或实验周期长可以-20℃长期固定）。离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞两次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙锭（PI），100ug/mLRNaseA，4℃避光孵育30分钟，上机检测。样本来源培养的细胞、血液、骨髓、体液、组织等的单细胞都可用于DNA分析；标本数应大于106注意获得单个细胞，尽量避免DNA降解；样本关键减少碎片（无EDTA/不可过度吹打/离心）；PI既能和DNA结合，又能跟RNA结合，所以要用RNase降解脱氧核糖核酸酶会降解DNA,故耗材试剂要干净灭菌。流式细胞术应用----细胞凋亡细胞凋亡概念为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。是机体主动、高度有序清除无用细胞的过程。是生物体中一种普遍存在的现象。区别于细胞坏死（外力引起的细胞无序变化的死亡过程）细胞凋亡多事件发生早期：AnnexinV（PS外翻）早中期：JC-1(线粒体膜电位)中晚期：caspase-3、8、9（western）晚期：TUNEL（DNA片段）不同时期凋亡检测指标早期凋亡特征：•磷脂膜（PS）外翻，但是细胞膜保持完整性，因此PI染色为阴性•DNA没有发生断裂AnnexinV（磷脂结合蛋白）对照设置：空白对照：不加AnnexinV/PI,用以调节电压，阴阳性细胞界限单阳对照：诱导凋亡，AnnexinV/PI单染，用来补偿双染阴性对照：未诱导的AnnexinV+PI双染。用它确定两荧光通道电压，排除非特异性结合注意：•细胞制备或存储时细胞膜损伤，造成假阳性•贴壁细胞消化时避免使用EDTA，螯合钙离子•当样本表达GFP时，禁用AnnexinV-FITC推荐使用AnnexinV-APC/7-AAD染色JC-1(BIC2)检测线粒体膜电位变化原理：JC-1有单体跟多聚体两种形式。浓度高时，JC-1呈多聚体，可以产生红色荧光；在浓度较低时，JC-1为单体，可以产生绿色荧光。正常细胞：膜电位正常，JC-1随线粒体膜极性进入线粒体，随浓度升高而成多聚体，发红色荧光。凋亡细胞：线粒体膜去极化，JC-1从线粒体释放，浓度降低，转为单体，发绿色荧光。通过检测红绿两种荧光区分。Caspase-3检测-细胞凋亡过程中，胞内主要蛋白通常被降解，调节这一过程的蛋白叫做Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶)。–Caspase3是参与DNA维护和调控细胞的重要组分，即Caspase3激活=细胞凋亡TUNEL检测凋亡晚期特征—DNA内切酶活性激活升高，双链DNA切断形成~185bp的有序片段。—Tunel流式法:基因组DNA断裂时，暴露的3‘-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(TerminalDeoxynucleotidylTransferase,TdT)的催化下加上荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，通过流式细胞仪进行检测。一步法FITC-dUTP染色凋亡细胞流式细胞仪488nm激发，PI发出623nm荧光，FITC发出520nm荧光两步法PI染总DNA(周期)FITC-dUTP染色凋亡细胞（如不需要周期信息，可不做PI染色）TUNEL检测TUNEL检测小结：细胞凋亡---流式分析活细胞细胞凋亡流式分析固定细胞膜不对称性改变AnnexinV线粒体膜电位变化Mitoscreen(JC-1)TUNEL/DNA片段化流式的其他应用黏附因子表面受体细胞因子分泌到胞外的细胞因子胞内抗原核酸含量核内抗原流式细胞仪预约使用规范CytoFlex预约使用规范每周一、三、五（10:00-16:30）为流式预约使用时间段需要使用流式的同学请至少提前一天预约预约成功后，必须准时上机检测临时有事不能进行实验的同学，请至少于检测前一小时告知实验结束后，及时带走检测完的样本，并登记检测时间数据拷取必须使用实验室配备专门U盘。谢谢！！