PDF-猪瘟病毒野毒株TaqMan-MGB荧光定量PC

中国农业科学2009,42(12):4366-4371ScientiaAgriculturaSinicadoi:10.3864/j.issn.0578-1752.2009.12.031收稿日期：2008-10-22；接受日期：2009-09-01基金项目：“十一五”国家支撑计划课题（2006BAD06A12，2006BAD06A18）、北京市自然科学基金（5072041）作者简介：刘俊（1982－），男，土家族，湖北咸丰人，硕士，研究方向为兽医生物技术与生物制品研制。通信作者王琴（1962－），女，四川南充人，研究员，博士，研究方向为重大猪病预防与控制。Tel：[phone]；Fax：[phone]；E-mail：[e-mail]猪瘟病毒野毒株TaqMan-MGB荧光定量PCR鉴别方法的建立与应用刘俊1,2，王琴1，范学政1，徐璐1，赵启祖1，黄伟2，汤波1,2，沙莎2，周远成1，陈蕾1，邹兴启1（1中国兽医药品监察所/国家猪瘟参考实验室，北京100081；2西南大学荣昌校区，重庆402460）摘要：【目的】建立一种快速、敏感、特异地检测猪瘟病毒野毒的一步TaqMan-MGB荧光定量PCR方法，为临床鉴别猪瘟野毒和HCLV疫苗毒提供了准确可靠的工具。【方法】在猪瘟病毒基因组5′端非编码保守区设计一对猪瘟病毒通用引物和一条特异性MGB探针，通过优化，得到最佳反应体系和反应条件，进行特异性、灵敏度和临床样本符合检验。【结果】该方法在100～10-7范围内线性相关系数为0.998，检测极限达5.3×10-2pg病毒核酸；对24个质控样本检测结果显示，该方法能检测除猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）以外的猪瘟流野毒株，其它猪相关致病病原检测阴性；对122份疑似猪瘟样本检测的结果与本实验室建立的RT-nPCR方法的符合率为94.3％（115/122），阳性和阴性符合率分别为86.4％（38/44）和98.7％（77/78）,Kappa值为0.87＞0.75。【结论】建立的一步TaqMan-MGB荧光定量PCR方法能鉴别猪瘟野毒和HCLV疫苗毒，且特异性好、灵敏度高、与笔者先前建立的RT-nPCR方法对临床样本的检测结果具有高度的一致性。关键词：猪瘟；荧光定量PCR；TaqMan-MGB；兔化弱毒疫苗DifferentiationofWild-TypeVirusesandHCLVVaccineofClassicalSwineFeverVirusbyOne-StepFluorescentQuantitativePCRUsingTaqMan-MGBProbeTechnologyLIUJun1,2,WANGQin1,FANXue-zheng1,XULu1,ZHAOQi-zu1,HUANGWei2,TANGBo1,2,SHASha2,ZHOUYuan-cheng1,CHENLei1,ZOUXing-qi1(1ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,NationalClassicalSwineFeverReferenceLab,Beijing100081;2SouthWestUniversityRongchangCompus,Chongqing402460)Abstract:【Objective】ArapidonestepfluorescentquantitativePCRassayusingTaqManminor-groove-binding(MGB)probewasdevelopedandevaluatedtodiscriminatewild-typestainsfromwild-typestainsandhogcholeralapinizedvirus(HCLV)strainofclassicalswinefevervirus(CSFV).【Method】Apairofuniversalprimerandawild-typespecificMGBprobeweredesignedfromtheconservativeregionofCSFVgenome.Thenthemethodwasoptimized.Specificity,sensitivity,andconformityweretested.【Results】Thedetectionresultsof24quality-controlsamplesshowedgoodspecificity.Thesensitivityoftheassaywas5.3×10-2pgviralRNAperreaction,andshowedagoodlinearrelationshipatarangeof100-10-7.Thecoincidenceratewas94.3%indetecting122clinicalsamplescomparedwithRT-nPCR(115/122)，andthepositivecoincidencerateandnegativecoincidenceratewere86.4%(38/44)and98.7%(77/78),respectively,Kappavaluewas0.87＞0.75.【Conclusion】Theone-stepTaqMan-MGBPCRisabletodifferentiatewild-typeandHCLVofCSFVstrain,whichshowsgoodspecificity,sensitivityandalsoshowshighconsistencyofTaqMan-MGBProbeTechnologyandRT-nPCRmethod.ThisassaymayserveasausefuldiagnostictoolforCSF.Keywords:classicalswinefever;fluorescentquantitativePCR;TaqMan-MGB;CSFV12期刘俊等：猪瘟病毒野毒株TaqMan-MGB荧光定量PCR鉴别方法的建立与应用43670引言【研究意义】猪瘟（classicalswinefever，CSF）是由猪瘟病毒（classicalswinefevervirus，CSFV）引起的猪高度接触性致死性传染病，给世界养猪业造成巨大威胁和经济损失[1]，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的法定传染病之一。在中国CSF依然十分严重，被列为一类动物传染病，且已纳入国家强制免疫计划。CSFV是黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）的成员[2-3]，基因组为12.5kb，为单股正链RNA，编码一个大的开放阅读框（ORF），其5′端和3′端为非编码区，高度保守[4]。同属的还有牛病毒性腹泻病毒（bovineviraldiarrheavirus，BVDV）、绵羊边界病毒（borderdiseasevirus，BDV），均能引起猪的感染，且存在血清学交叉反应，给CSF的鉴别诊断带来了困难[5]。且近年来中国CSF发病呈非典型、温和型增加态势，再加上HCLV疫苗的大规模使用，使得感染野毒株和疫苗毒株无法区分，这也增加了CSF临床诊断的难度，而现有的CSF诊断方法如免疫荧光、ELISA[6]、病毒分离[7]、RT-PCR等都存在敏感性和特异性低，耗时等不足[8-9]，且不能区分野毒株和疫苗株。因此，建立一种快速、敏感、特异地检测CSFV野毒株的分子生物学诊断方法势在必行[10]。【前人研究进展】荧光定量PCR（fluorescentquantitativePCR，FQ-PCR）从1996年诞生至今，因其快速高效、特异灵敏、高通量而备受关注[11-12]。FQ-PCR分为染料法和探针法两种，MGB探针是其3′端经特殊处理的一类探针，能检测模板结合区甚至1个碱基的突变，且本底荧光信号低。染料法和普通探针法在CSFV的检测方面已有应用，Risatti[13]2003年首次建立了CSFV的FQ-PCR方法；2007年，Liu[14]将CSFV检测一步RT-PCR方法与FQ-PCR方法进行了比较，认为前者适合低成本检测，后者能实现高通量；2008年Jamnikar[15]对染料法和MGB探针法进行了比较，认为MGB探针法定量优于前者。【本研究切入点】然而，临床迫切需要一种能区分野毒和疫苗毒方法的出现，2006年Cho[16]首次利用MGB探针建立了区分韩国5K-LOM疫苗株和野毒株的方法；2008年国内有学者[17-18]也建立了能区分HCLV疫苗株和野毒株的多重RT-PCR方法和FQ-PCR方法，前者有PCR后处理，易污染；后者虽勿需后处理，但与前者一样，分两步进行，费时。【拟解决的关键问题】笔者以期利用MGB技术，建立快速、特异的CSFV野毒与HCLV疫苗毒的鉴别方法。为临床CSF，特别是非典型、温和型及潜伏野毒感染CSF的诊断提供一个快速、准确的方法。1材料与方法1.1引物与探针参考GenBank中公布的CSFV石门（shimen）株、猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV）、Alfort187株、CAP株、Brescia株、Thiverval株等多条CSFV基因组序列，同时参考BVDV、BDV基因组序列，应用DNAMAN软件进行序列比对分析，查找猪瘟兔化弱毒疫苗株与其他疫苗毒及强毒基因组5′端保守区的差异位点，利用PrimerExpress1.2软件（ABI7500）设计了一套CSFV通用引物MGB-F：CATGCCCACAGTAGGACTAGCAAA；MGB-R：GAACTACTGACGACTGTCCTGTACTCA和强毒特异性MGB探针MGB-P：CTAGCCGTAGTGGCGA。探针5′标记FAM，上海基康生物技术公司合成。1.2病毒本方法的建立共用24个质控毒株，其中CSFV毒株的背景信息参见文献[19]，其它毒株背景信息见表1。表1质控毒株背景Table1Backgroundinformationofqualitycontrolstrains毒种名称Nameofisolatesandvaccines来源Source毒种名称Nameofisolatesandvaccines来源SourceShimenCVCCGXBH1/98NCSFVRL,ThivervalCVCCGDGZ1/95NCSFVRL,USA-331CVCCFJFZ12/00NCSFVRL,HCLVA、B、C、D、EBVDV-NADLCVCCBJTX3/96NCSFVRL,ChinaBVDV-OregonC24VCVCCBJCY1/96NCSFVRL,ChinaPPV09/79CVCCBJSY1/01NCSFVRL,ChinaPRRSV/BJCVCCHeBZJK1/99NCSFVRL,ChinaPCV-2/71CVCCHeBHH1/95NCSFVRL,ChinaPRV-BJ/99、SCAUHeNXH2/98NCSFVRL,ChinaPRV/FaSCAUJL1/94NCSFVRL,ChinaFMDV-O(killedstrain)IVDCFJFZ14/00NCSFVRL,ChinaFMDVAsiaⅠ(killedstrain)IVDCCVCC：国家兽医微生物菌种保藏管理中心；NCSFVRL：国家猪瘟参考实验室；SCAU：四川农业大学；IVDC：中国兽医药品监察所；A：北京乾元浩；B：广西生物制品厂；C：山东泰丰；D：广东永顺；E：广东大华农集团CVCC:ChinaCeterinaryCulturecollectionCenter;NCSFVRL:NationalClassicalSwineFeverReferenceLaboratory,China;SCAU:SichuanAgriculturalUniversity;CVDC:ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl;A;FactoryofQianyuanhao,Bei