己烯雌酚人工抗原的制备和间接竞争ELISA检测方法的建立

湖北大学硕士学位论文己烯雌酚人工抗原的制备和间接竞争ELISA检测方法的建立姓名：汪晓莉申请学位级别：硕士专业：微生物及生化药学指导教师：杨艳燕20090501己烯雌酚人工抗原的制备和间接竞争ELISA检测方法的建立作者：汪晓莉学位授予单位：湖北大学相似文献(10条)1.学位论文邴爱英己烯雌酚人工抗原的合成及ELISA检测方法的建立与应用2006己烯雌酚为人工合成的二苯乙烯类雌激素药，曾经作为促生长剂广泛应用于畜牧业，以促进动物生长，提高产量。但国内外研究表明，己烯雌酚具有很强的副作用，可以破坏机体遗传物质，导致基因突变而引发机体肿瘤。目前，世界上许多国家已规定在畜禽及水产养殖中禁用DES。然而，当前滥用己烯雌酚的现象依然存在。为了确保人类安全与健康，建立快速、准确地检测动物性食品中DES残留是十分必要的。本研究以己烯雌酚、琥珀酸酐和牛血清白蛋白等为主要原料，首先通过琥珀酸酐酰化，生成己烯雌酚半琥珀酸酯，然后采用混合酸酐反应(氯甲酸异丁酯法)将己烯雌酚半琥珀酸酯与牛血清白蛋白进行偶联制备己烯雌酚免疫原，并与卵清蛋白进行偶联制备己烯雌酚包被原。用此免疫原免疫家兔，并以间接ELISA法测定抗体效价。试验结果表明，被免疫兔血清中的抗DES抗体效价高达28，证明合成的人工抗原具有很强的免疫原性，能够刺激兔体分泌高效价的目的抗体。通过检测免疫兔血清中的抗体效价，建立了具有较好特异性、敏感性和稳定性的间接ELISA检测方法，并通过方阵试验，确立了最佳工作条件。确定其抗原最佳包被浓度为9.6μg/ml；抗原在4℃、包被24h，37℃、封闭3h时效果最好；酶标二抗的最佳稀释度为1∶800，最佳作用时间为60min；抗原抗体最佳作用时间为60min。利用纯化抗体经生物素标记，可同辣根过氧化酶标记的亲和素特异结合的原理，建立了双抗体夹心ELISA法。采用纯化的抗体包被96孔板，形成固相抗体。加入不同浓度的己烯雌酚标准品后，再加入生物素标记抗体，以辣根过氧化物酶标记亲和素作为探针，经酶底物显色反应可获得良好的ELISA标准曲线。该方法操作简便、灵敏度高、特异性强，不需特殊设备，检测灵敏度为0.125ng/ml，可定量检测范围为0.25～15.60ng/ml，可满足实践中一般样品的残留检测。本研究还用建立的双抗体夹心ELISA方法对饲料样品中的DES残留进行了检测，并用购买的己烯雌酚残留检测试剂盒作对照。试验采用振摇与超声结合的方法提取饲料样品中的己烯雌酚，然后采用液液萃取和pH调节去除大部分杂质，净化后再进行检测。采用双抗体夹心法测得饲料中的DES残留量在0.5～62.4μg/kg范围内；采用试剂盒测得饲料样品中DES的残留量分别为0.55μg/kg、0.85μg/kg、0.45μg/kg。结果表明，建立的双抗体夹心ELISA法灵敏度比较高，是筛选性检测饲料中己烯雌酚残留的有效方法。2.期刊论文古艳丽.曲志娜.陈德坤.郑增忍.路平.刘爽.李葳.张桂金.谭维泉.GuYanli.QuZhina.ChenDekun.ZhengZengren.LuPing.LiuShuang.LiWei.ZhangGuijin.TanWeiquan己烯雌酚人工抗原的合成和酶免疫检测方法的建立-中国农学通报2006,22(9)通过化学方法合成己烯雌酚单羧甲基醚,并通过核磁共振和质谱进行鉴定;分别用混合酸酐法和碳二亚胺法将其与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)偶联,合成己烯雌酚人工抗原,经紫外扫描、聚丙烯酰胺凝胶电泳和动物免疫试验证实人工抗原合成成功,并制备了抗己烯雌酚的特异性多克隆抗体,同时建立了己烯雌酚的酶免疫检测方法,这对动物性食品中己烯雌酚的残留检测有重要意义.3.期刊论文刘雅红.单国强.康彦龙己烯雌酚人工抗原的合成研究-中国兽医科技2003,33(10)采用三步反应合成了己烯雌酚人工抗原,为己烯雌酚酶免疫检测技术的进一步研究奠定基础.试验结果证实,己烯雌酚及其衍生物存在着顺反异构转化现象,酸碱处理是降低交联前衍生物中顺式体比例的有效方法;经三步合成,成功地制备出了人工抗原;人工免疫原及包被原的最适结合比例分别为1∶28和1∶7.4.学位论文雷莉辉己烯雌酚人工抗原的研究2004已烯雌酚(diethylstilbestrol,DES)属于人工合成的雌激素,在人和动物体内会产生雌激素样效应.在养殖业中,DES能够显著促进动物的生长,提高饲料转化率,但由于DES对人体的致癌和致畸作用,世界各国均规定食品动物养殖中不得以任何途径和方式使用DES,动物及动物性食品中不得检出DES.DES残留免疫分析是DES残留监控中的重要手段之一.该研究属于DES残留免疫检测试剂盒研制的前期工作内容,也是必不可少的研究.研究取得如下结果:1.在室温条件下,将DES与丁二酸酐按一定比例溶解于无水吡啶中,搅拌反应生成棕黄色物质,将其分离纯化后对其进行高分辨质谱、红外光谱、核磁共振碳谱及氢谱等鉴定,试验结果表明,该棕黄色物质分子量为368,分子式为C22H2405,含有酚羟基、羧基等关键基团,为所要制备的DES衍生物已烯雌酚半琥珀酸(DES-HS).2.利用混合酸酐法将DES-HS与载体蛋白(BSA,OVA)进行偶联得到DES人工抗原.合成的人工抗原经紫外扫描、SDS-PAGE凝胶电泳鉴定证明DES-HS与载体蛋白偶联成功;并用UVPBioimagingsystem中的labworks4.0ImageAcquisitionandAnalysissoftware分析估算BSA与DES-HS的偶联率为1:30~32.OVA与DES-HS的偶联率为1:25~28.3.用合成的DES-HS-BSA结合物分别免疫家兔和Balb/c小鼠,采集免疫动物血清.应用琼脂双扩散试验和间接ELISA试验、阻断ELISA检测特异性DES抗体的产生,抗体效价及其与游离DES反应的特异性.结果表明:无论免疫兔还是免疫小鼠,其免疫血清均能够与DES-HS-OVA上的DES决定簇发生特异性结合反应;免疫兔血清效价不低于1:6000,免疫小鼠血清效价不低于1:12000;兔免疫血清能够与游离DES发生特异性反应.通过上述研究和分析,可得出如下的结论:建立了DES-HS制备方法;成功地制备出了DES的人工抗原;用DES-HS-BSA分别免疫兔和小鼠制备出了抗DES免疫血清;建立了DES抗体的间接ELISA检测方法.该研究为研制DES单克隆抗体及拥有中国自主知识产权的DES残留免疫检测试剂盒奠定了基础.5.期刊论文邴爱英.成连贵.朱建华.牛钟相.BINGAi-ying.CHENGLian-gui.ZHUJian-hua.NIUZhong-xiang己烯雌酚人工抗原的合成及其抗体制备-西北农业学报2006,15(5)以己烯雌酚(DES)、琥珀酸酐和牛血清白蛋白(BSA)等为主要原料,采用混合酸酐反应(氯甲酸异丁酯法)将半抗原己烯雌酚与载体蛋白BSA联接制备成人工免疫原.用此免疫原免疫家兔,并以间接ELISA法测定抗体效价.结果表明,人工合成的抗原具有很强的免疫原性,被免疫兔血清中的抗DES抗体效价高达28.本试验为下一步制备抗DES单克隆抗体及研制快速检测DES残留的免疫试剂盒奠定了基础.6.学位论文古艳丽己烯雌酚单克隆抗体和酶标抗原的研制2006己烯雌酚(diethylstibestrol，DES)是一种人工合成的雌激素，在促进动物蛋白质的合成代谢、提高动物日增重和减少脂肪等方面效果明显，因此一直被作为一种动物生长促进剂用于畜禽以及水产品养殖中。国际癌症研究机构(IARC)研究发现，DES是一种致癌物质，能够在动物源性食品如肝脏、肌肉、蛋、奶中残留，并通过食物链危害人体健康。因此世界各国均规定食品动物养殖中不得以任何途径和方式使用DES，养殖动物及动物性食品中不得检出DES。DES残留免疫分析是DES应用监控的一种重要手段，本文通过DES人工抗原的制备和鉴定、抗DES多克隆和单克隆抗体的制备和鉴定、DES酶标抗原合成以及酶免疫检测DES方法的建立等研究，旨在研制DES酶免疫检测试剂盒。对己烯雌酚进行了结构修饰，用有机合成方法合成了DES单羧甲基醚，并通过红外、质谱和核磁共振氢谱鉴定合成成功；通过混合酸酐法和碳二亚胺法分别将DES单羧甲基醚与大分子蛋白质载体牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)偶联，合成了四种人工抗原，并通过紫外扫描和SDS-PAGE凝胶电泳鉴定偶联成功，其中BSA与DES的偶联率约为1∶30，OVA与DES的偶联率为1∶18。用混合酸酐法合成的BSA-DES免疫4只家兔，用混合酸酐法合成的OVA-DES和碳二亚胺法合成的OVA-DES免疫两组小鼠，获得了3种抗血清，选用不同的包被原，通过间接ELISA和间接阻断ELISA法对3种抗血清进行了鉴定，兔血清抗体效价在1∶10000以上，小鼠血清抗体效价在1∶8000以上，三种抗血清都能和DES特异性结合，同时建立了ELISA检测方法。选用混合酸酐法合成的BSA-DES免疫Balb/c小鼠，用碳二亚胺法合成的OVA-DES做包被检测原，间接ELISA检测小鼠血清效价均在1∶1×105以上，选择其中效价最高的两只小鼠脾细胞，在PEG的作用下与SP2/0瘤细胞融合，通过间接ELISA法检测了单抗杂交瘤细胞培养上清中的抗体效价达1∶400以上，同时建立了DES残留检测的酶免疫检测方法，其中检测限达0.2μg/Kg。用碳二亚胺法合成了酶标抗原HRP-DES，通过ELISA法证明了HRP-DES的正确合成。同时，建立了固相抗体竞争ELISA法检测DES残留，并绘制了检测曲线。本研究首先将DES衍生成DES单羧甲基醚，通过两种偶联方法和两种载体合成了四种不同的人工抗原，通过兔子和小鼠的免疫试验，成功制备了高效价特异性DES抗血清和单克隆抗体，建立了DES残留检测的竞争ELISA方法，同时成功制备了HRP-DES，为组装DES酶免疫检测试剂盒奠定基础。7.期刊论文陈德坤.郑增忍.曲志娜.雷莉辉.张佩君己烯雌酚人工抗原的合成及其抗体制备-中国兽医学报2004,24(4)以己烯雌酚(DES)、琥珀酸酐和牛血清白蛋白(BSA)等为主要原料,采用混合酸酐反应,首先合成己烯雌酚半琥珀酸酯(DES-HS),经质谱分析鉴定后,再将DES-HS结合到BSA上,并用SDS-PAGE对DES-HS-BSA进行测定.以DES-HS-BSA免疫家兔6次,用琼脂双扩散试验测定抗体.试验结果表明,高分辨质谱测得合成的DES-HS分子量为368;BSA-HS-DES的SDS-PAGE图谱经相关软件分析表明,单个BSA上结合有32个DES-HS;琼脂扩散试验结果证实,免疫兔血清中含有抗DES的抗体.本试验为下一步研制DES残留免疫检测试剂盒及抗DES单抗奠定了基础.8.学位论文王恒己烯雌酚免疫分析化学研究2006以己烯雌酚(DES)为研究对象，合成了半抗原己烯雌酚-单-羧基甲基-醚(DES-MCME)和己烯雌酚-单-羧基丙基-醚(DES-MCPE)，采用活性酯法和混合酸酐法将DES-MCME和DES-MCPE分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)共价偶联，制备了人工抗原DES-MCME-BSA和DES-MCPE-BSA，包被原DES-MCME-OVA(包被原Ⅰ)和DES-MCPE-OVA(包被原Ⅱ)。根据紫外扫描图谱确定是否偶联成功并计算结合比，考察了反应物不同的摩尔比对最终偶联物结合比的影响。结果表明，当采用活性酯法偶联时，半抗原与BSA反应的投料摩尔比应在50∶1左右为宜，生成的偶联物的结合比为10～30∶1。分别以DES-MCME-BSA和DES-MCPE-BSA免疫新西兰白兔制备抗血清。双向琼脂扩散法测定抗血清效价大于32∶1后采集全血，离心分离血清，并以硫酸铵分步盐析分离抗血清中的抗体，冷冻干燥后-20℃保存。以DES-MCME-BSA为免疫原制备的抗体Ⅰ对己烯雌酚无亲和力，而以DES-MCPE-BSA为免疫原制备的抗体Ⅱ对己烯雌酚具有特异性亲和力。以包被原Ⅱ进行固相