酶联免疫吸附反应(ELISA)Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay

酶联免疫吸附反应（ELISA）Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay一、ELISA简介二、ELISA原理三、ELISA分类四、ELISA相关试剂五、ELISA影响因素六、ELISA应用一、ELISA简介•1971年瑞典学者Engvall和Perlmann，荷兰学者VanWeeman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附实验（Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay，ELISA）。•自上世纪70年代初问世以来，ELISA发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。二、ELISA原理•ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。•结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。•在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）抗原•凡是能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞并能与之结合引起特异性反应的物质称为抗原（antigen）。•抗原的分子结构十分复杂，但抗原分子的活性和特异性并不是决定于整个抗原分子，决定其免疫活性的只是其中的一小部分抗原区域。抗原分子表面具有特殊立体构型和免疫活性的化学基团称为抗原决定簇（antigenicdeterminant）或抗原决定基。抗体•动物机体受到抗原物质刺激后，由B淋巴细胞转化为浆细胞产生的，能与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白，这类免疫球蛋白称为抗体（antibody，Ab）。•免疫球蛋白是蛋白质，因此一种动物的免疫球蛋白对另一种动物而言是良好的抗原。免疫球蛋白不仅在异种动物之间具有抗原性，而且在同一种属动物不同个体之间，以及自身体内同样是一种抗原物质。免疫标记技术放射物标记技术酶标技术免疫荧光技术其他标记技术酶联免疫吸附技术酶免疫组化技术双抗体夹心法竞争法双抗原夹心法间接法三、ELISA分类双抗体夹心法竞争法间接法ELISA基本实验过程•包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化•抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定•酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色实验中对照的设置•阳性对照•阴性对照•空白对照•临界标准品四、ELISA相关试剂•01.印迹膜•02.封闭液•03.样品稀释液•04.浓缩洗涤液（10X）•05.酶联物•06.AP底物•07.八孔板•08.判读卡•09.记录纸•10.说明书•01、微孔反应板•02、酶联物•03、TMB底物•04、样品稀释液•05、浓缩洗涤液（10X）•06、终止液•07、阳性质控物•08、阴性质控物•09、临界质控物•10、说明书ELISA试剂（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液。固相抗原或抗体1、固相载体的性状•固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。•ELISA载体的形状主要有：膜（NC膜、PVDF膜、尼龙膜）、微量滴定板（96孔板）、小珠和小试管，以微量滴定板（96孔板）最为常用。•良好的ELISA用96孔板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。2、包被用抗原•用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。3、包被条件酶标记的抗原或抗体（结合物）1、酶•用于ELISA的酶应符合以下要求：（1）纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵；（2）制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力；（3）在受检标本中不存在相同的酶；（4）相应底物易于制备和保存，价格低廉；（5）有色产物易于测定，光吸收高。•常用的酶为辣根过氧化物（horseradishperoxidase，HRP）和碱性磷酸酶（alkalinephosohatase，AP）。酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐橘红色黄色棕色兰色蓝绿色492460449425642碱性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色红色400500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色深蓝色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光黄色360,4504202、抗原和抗体•制备结合物时所用抗体一般均为纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。•在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。3、结合物的制备•酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。4、结合物的保存•酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质，保存不当，极易失活。高浓度的结合物较为稳定，冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右。酶的底物1、HRP的底物•HRP催化过氧化物的氧化反应，常用的供氢体有邻苯二胺（OPD）、四甲基联苯胺（TMB）和ABTS。•TMB经HRP作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，无致癌性等优点。酶反应用HCl或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，2、AP的底物•AP为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯（p‐NPP）作为底物。•产物为黄色的对硝基酚，用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。•NBT/BCIP，紫色反应，水冲洗终止反应。•试剂因素•标本因素•实验原理或操作方法•环境因素五、ELISA影响因素●抗原抗体的纯度●标准品定值的准确性●抗体的亲和力、滴度和特异性●标记物的比活性或免疫活性试剂因素•内源性物质常见的有:类风湿因子（RF）、嗜异性抗体（Id）、补体、人抗动物抗体（HAAA）、药物及其导致的代谢产物和交叉反应物质等。•外源性物质主要为：标本溶血、标本细菌污染、标本储存时间过长、标本凝集不全和采血管中含有添加剂等。•自身免疫产品：胆红素浓度小于0.05mg/mL的黄疸，血红蛋白浓度小于5.0mg/mL的溶血和甘油三酯浓度小于25.0mg/mL的脂血对检测结果没有影响。标本因素•钩状效应（HOOK效应）及交叉反应现象•颜色终止条件ELISA实验终止剂选用引起的持续发展的颜色加深影响了阴性和弱阳性样品及定量检测样品的结果,特别在大批样品需较长时间进行读数时,这种潜在的颜色逐渐加深现象成为结果影响的重要因素。•ELISA的洗板过程洗液冲力过大会造成酶结合物丢失,本底偏浅,吸光度值偏低,且洗板后残留液规定一般不超过2ul。实验原理或操作方法•通风、采光与防尘。•控制温度及湿度,环境温度与湿度随地理位置不同可有很大差异应使用系统空调进行控温,并要求控制空气湿度为40%～70%之间•消除噪音与电磁干扰。•稳定水电,实验过程中应采用蒸馏水(纯水)或经软化处理的自来水。环境因素六、ELISA应用饲料中盐酸克伦特罗的测定饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素，简曲霉毒素）饲料中有害微生物的快速筛检（如沙门氏菌）甲胺磷残留分析甲基对硫磷残留分析呋喃丹残留分析ELISA在饲料安全检测中的应用ELISA用于农药残留的检测河豚毒素植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素苯并芘主要有除草剂与杀虫剂两大类例如杀暝松（FN）、甲氟磷酸异已酶（SOMAN）、草不绿（Alachor）、西维因（Carbaryl）、多菌灵及克菌丹（Captan）等。农药的检测ELISA检测“非典型肺炎”冠状病毒ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用检测抗异质性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2）/类风湿性关节炎（PtA）33抗体ELISA在疾病诊断中的作用ELISA法检测幽门螺杆菌抗体其他一些酶标记免疫技术斑点酶免疫吸附实验•此试验所用固相载体对蛋白质具有极强吸附力的醋酸纤维膜。•优点：NC膜吸附蛋白力强，微量抗原吸附完全，故检出灵敏度高；试剂用量少；操作简便，不需特殊设备；吸附抗原或已有结果的NC可长期保存。生物素-亲和素放大系统（BAS）•生物素-亲和素系统是以生物素-亲和素具有的独特结合特性为基础，结合二者即可偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，他们的结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。•优点1.灵敏度高2.特异性强（不增加非特异性干扰）3.稳定性好4.适用性强