大鼠缺血再灌注心肌TLR4、TNF-α表达变化及其关系研究

大鼠缺血再灌注心肌TLR4、TNF-α、NF-κB表达及其关系的研究刘冬云1刘坤申2摘要：目的研究缺血再灌注大鼠心肌TLR-4、TNF-α和NF-κB的表达及相互关系。方法建立大鼠缺血再灌注模型，大鼠随机分为假手术组、缺血组、再灌注30min组、再灌注60min组、再灌注90min组。以RT-PCR法检测心肌中TLR4及TNF-αmRNA的表达。结果各种心肌中均检测到TLR4的表达，缺血及再灌注后TLR-4mRNA含量显著增加，随着再灌注时间延长，TLR-4mRNA含量增加更为显著。缺血组与假手术组TNF-αmRNA表达没有显著差异，而再灌注后表达显著增加，随再灌注时间延长，TNF-αmRNA含量继续增加更为明显。缺血及再灌注后心肌NF-κBmRNA表达增加，随再灌注时间延长，NF-κBmRNA含量继续增加，且具统计学意义。TLR-4表达增加时TNF-α和NF-κB表达也增加，三者有一定相关性。结论心肌缺血再灌注损伤使TLR-4、TNF-α表达增高，阻断TLR-4可能有助于减轻缺血再灌注所致心肌损伤，并抑制急性炎症反应的发生。关键词：缺血再灌注损伤心肌Toll样受体4TNF-αNF-κBExpressionofTLR-4、TNF-αandNF-κBInratcardialmusclesduringischemia-reperfusionLIUDong-yun1LIUKun-shen2(1EmergencyDepartment,BethuneInternationalPeacehospitalofChinesePLA,CardialogyDeparment,theFirstClinicHospitalofHebeiMedicalUnivrersity,050082Shijiazhuang,HebeiChina)Abstract:ObjectiveToinvestigatetheexpressionofTLR-4、TNF-αandNF-κBInratcardialmusclesduringischemiareperfusion.MethodsTwenty-fivefemaleSDratswererandomlydividedintoshamoperationgroup(n=5),ischemiagroup(n=5),ischemiareperfusion30mingroup(n=5),ischemiareperfusion60mingroup(n=5),ischemiareperfusion90mingroup(n=5),ExpressionlevelofTLR4、TNF-αweremeasuredbyRT-PCR.ResultTheexpressionlevelofTLR4、TNF-αandNF-κBsignificantlyincreasedafterischemia-reperfusion.,therearepositivecorrelationamongthem.ConclusiongsThesedatasuggestthatmyocardialischemia-reperfusioncanresultinintensiveactivationofTLR-4、TNF-α.andNF-κB.TreatmentwithinhibitorstoTLR4maybebenefitforattenuationofmyocardialinjuryinducedbyischemia-reperfusionandsubsequentacuteinflammatoryresponse.Keywords:TLR-4;ischemia-reperfusion;NF-κB;TNF-α心肌缺血再灌注损伤（Myocardiumischemia-reperfusioninjury,MIRI）是心肺复苏、心肌梗塞溶栓和介入治疗、以及心脏移植中的重要病理生理过程。局部及全身炎症是缺血再灌注损伤的特征，但激发炎症的具体过程未完全阐明。由于Tool样受体（TLR-4）在识别细菌LPS及介导的炎症反应信号转导中的重要作用[1]，其在心肌缺血再灌注损伤中的作用也越来越多的引起关注。目前缺血再灌注1作者单位：050082河北石家庄河北医科大学（刘冬云）河北医科大学第一附属医院心内科（刘坤申）2作者简介：刘冬云（1969－），女（汉族），吉林蛟河人，医学硕士，主要研究方向为危重病急救3通讯作者：刘坤申，男，主任医师，博士生导师心肌中TLR-4的研究正处于起步阶段，本实验通过研究缺血再灌注大鼠心肌TLR-4、TNF-α和NF-κB的表达，探讨TLR-4在缺血再灌注损伤中的作用。材料与方法：1.1材料实验所用无RNA酶处理的DEPC，Trizol购于北京赛百盛生物公司，逆转录试剂盒购自宝生物工程有限公司,核酸酶抑制剂及Taq酶购于宝生物工程有限公司。所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。美国Beckman公司台式冷冻高速离心机，上海瑞赛斯仪器有限公司组织机械匀浆机，美国UVP公司紫外凝胶成像分析系统。1.2方法1.2.1动物实验健康雄性SD大鼠(由河北医科大学动物中心提供)25只，体重平均200～250g饲养于清洁环境中，自由饮水，12h光照。依随机对照表等分为假手术组(A组)、缺血组(B组)、再灌注30’、60’、90’五组。缺血再灌注组取3%戊巴比妥钠90mg/kg腹腔注射麻醉，记录全导心电图，常规去毛，消毒皮肤，气管切开，插管，小动物呼吸机辅助呼吸，潮气量1-1.5ml/100g，呼吸次数60-80次/分，I：E=1：2，压力在5-15cmH2O之间，根据呼吸频率及强度调整呼吸参数。于左胸第3-5肋打开胸腔，暴露心脏，动脉圆锥及左心房之间下方1mm左冠状动脉前降支处，用7-0无损伤缝线穿过心肌表层，稳定10min后将一胶管平行置于冠状动脉表面，拉线推管，使胶管压迫冠状动脉造成心肌缺血，纹氏钳固定30min，放松结扎线后即行心肌缺血再灌注。缺血组7-0无损伤缝线直接结扎。假手术组开胸后暴露30min不结扎冠脉。实验动物模型要求达到下列要求：心肌缺血/再灌注过程中伴有心电图ST段变化或QRS波增宽；伊文氏蓝TTC染色法将心脏染色后可见明显的缺血/坏死区，当每组累积到5个成功模型时实验结束。1.2.2心肌组织总RNA的提取大鼠处死后，立即剪取心肌组织50～100mg,按照Trizol说明书的操作步骤提取总RNA。以适量无核酸酶水将RNA彻底溶解后,在紫外分光光度计上检测OD260及OD280,并进行1%琼脂糖凝胶电泳,分析RNA样品的纯度及浓度。上述实验中用到的所有耗材均经过无RNA酶以及无RNA酶的DNA酶处理。1.2.3TLR4mRNA及TNF-αmRNA表达的测定心肌中TLR4及TNF-αmRNA的表达检测采用RT-PCR法。按照试剂使用说明，先以心肌总RNA为模板，逆转录合成cDNA第一链。取上述逆转录产物2μl进行PCR反应，反应体系为50μl，包括1.25μl的Taq酶，终浓度为0.4μmol/L的5’和3’引物。以β-actin(340bp)作为内参照，其引物序列为:正义链:5’-GAAGTACCCCATTGAACACG-3’，反义链:5’-CAGGTCCAGACGCAGGATGG-3’。TLR4(178bp)的引物序列为:正义链5’-AGACATCCAAAGGAATACTGCAA-3’;反义链5’-GCCTTCATGTCTATAGGTGATGC-3′。反应条件为94℃预变性2min，94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸1min，30循环后，72℃补充延伸5min。TNF-α(171bp)的引物序列为:正义链5’-CTCCAGCTGGAAGACTCCTCCCAG-3’；反义链5’-CCCGACTACGTGCTCCTCACC-3’。反应条件为94℃预变性2min，94℃变性30s，59℃复性30s，72℃延伸1min30循环后，72℃补充延伸5min。NF-κB（100bp）的引物序列为：正义链5’-GAGAGCCCTTGCATCCTTTA-3’，反义链5’-CTTCCCTTTGGTCTTTCTGT-3’，TLR4、TNF-α及NF-κB的PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，片段大小经核酸分子量标准证实。ImageJ分析处理电泳图。1.2.4PCR产物测序将SD大鼠TLR4、TNF-α及NF-κB的RT-PCR产物进行测序(宝生物工程有限公司),证明本研究检测mRNA为TLR4、TNF-α和NF-κB。1.2.5主要结局观察指标：观察缺血及再灌注对大鼠心肌TLR4、TNF-α和NF-κB表达的影响。1.2.6统计学处理：应用SigmaStat3.5&Sigmaplot进行统计学处理，数据以x±s表示，多组方差分析。p0.05为有统计学差异。2结果2.1大鼠心肌TLR4mRNA的表达：RT-PCR法对各组大鼠心肌TLR4mRNA和的表达进行检测。各种心肌中均检测到TLR4的表达（见表1）。缺血组TLR4mRNA含量较假手术组显著增加。结果与文献报道一致。大鼠心肌再灌注TLR4mRNA表达再灌注30min后，TLR4mRNA含量增加，至再灌注90min更加显著。2.2大鼠心肌TNFαmRNA表达：RT-PCR测定各组心肌TNF-αmRNA表达（表1），缺血组与假手术组TNF-αmRNA表达没有显著差异，而再灌注30min后，其表达显著增加，与缺血组比较存在显著差异（p0.05）。随再灌注时间延长，TNF-αmRNA含量继续增加，且具统计学意义。2.3大鼠心肌NF-κBmRNA表达：RT-PCR测定各组心肌NF-κBmRNA表达（表1），缺血组较假手术组NF-κBmRNA表达增加，而再灌注30min后，其表达显著增加，与缺血组比较存在显著差异（p0.05）。随再灌注时间延长，NF-κBmRNA含量继续增加，且具统计学意义2.3TLR4扩增片段的测序:对SD大鼠TLR4、TNF-α和NF-κB的扩增产物进行测序，与GeneBank提供序列比较。结果证实检测TLR4mRNA、TNF-αmRNA和NF-κBmRNA(图2)。表1各组TLR4mRNA、TNF-αmRNA和NF-ΚbmRNA表达变化假手术组缺血组再灌注30’再灌注60’再灌注90’注：与假手术比较＊p﹤0.05与假手术组及缺血组比较﹟p﹤0.05注：1假手术组2缺血组3缺血30min组4缺血60min组5缺血120min组3讨论缺血再灌注损伤特征表现为氧合血液作用于缺血细胞产生的爆发性炎症反应。早期的研究[2]认为中性粒细胞浸润和活性氧自由基生成MIRI形成的重要原因，而近期研究则发现MIRI程度与中性粒细胞浸润数量无关，另一方面，多项应用抗氧化剂和抗白细胞粘附药物的大规模临床研究均未证实其有效性。因此，Hill和Ward提出IRI是以补体成分错误的攻击自身抗原为特征的先天性免疫应答。先天性免疫系统中能够识别病原分子模式的受体包括Toll样受体、补体和天然抗体。Toll样受体[3,4,5]（Toll-likereceptor,TLR）是新近发现的先天性免疫病原微生物的重要识别受体，能够同时激活先天性免疫应答和获得性免疫应答，因此成为构建机体先天性免疫和获得性免疫的桥梁。TLR4在人类所有细胞中表达，能够识别多种内源性和外源性配体，参与多种炎症过程，在Toll样受体家族中占有重要地位。Chong[6]等率先应用C3H/HeJ鼠（TLR4缺陷）研究观察TLR4在心肌R/I中的作用，发现与野生型小鼠C3H/HeN的小鼠)相比,在相似的危险区面积之下,C3H/HeJ的小鼠梗死区域大小下降了40%,印证了TLR4可能介导心肌缺血再灌注损伤的炎症反应的结论。。本研究应用SD大鼠，通过动物模型研究证实SD大鼠心肌中存在TLR4表达。通过RT-PCR检测发现，结扎大鼠冠状动脉前降支后出现TLR4mRNA含量增加，与再灌注后继续升高，随再灌注时间延长更加显著，表明TL