实验性肝癌中比较槐耳与IL-2对PTEN和IL-2R阳性细胞的影

实验性肝癌中比较槐耳与IL-2对PTEN和IL-2R阳性细胞的影响研究生陆鹏指导教师陈莉教授前言肝癌是我国第三位恶性肿瘤，约占全世界肝癌病例的42.5%。该病病程短、进展快、病死率高，严重危害着我国人民的健康和生命。槐耳清膏是一种入药1500年但湮没已300余年的重要药用菌，作为一种治疗肝癌的药用菌，在民间早已有应用。槐耳清膏标本经鉴定学名为TrametesRobiniophilaMurr.，中文名为槐栓菌。PTEN(与细胞骨架蛋白tensin同源在肿瘤的10号染色体有缺失的磷酸酯酶)是定位于10q23的一种具有磷酸酯酶活性的抑癌基因，PTEN蛋白能够抑制肿瘤的浸润和转移，诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期。IL-2被称为T细胞生长因子。IL-2主要以自分泌或旁分泌的方式，诱导特异性CTL克隆增殖，杀伤肿瘤细胞。本课题拟通过诱癌剂诱导大鼠肝癌，并通过应用槐耳清膏和IL-2干预癌形成过程，诱癌20周后观察肝组织的病理变化、IL-2R阳性细胞的表达情况以及PTEN表达水平，从而探讨与比较槐耳与IL-2对于肝癌形成与发展的影响，及其可能的作用机制。材料与方法1研究对象2主要试剂3方法40只雄性SD大鼠（本校实验动物中心）动物实验试剂二乙基亚硝胺（DENA，Sigma公司）、金克-槐耳清膏（江苏启东盖天力药业有限公司）、注射用重组人IL-2（江苏金丝利药业有限公司）。免疫组化试剂IL-2R/CD25α链单克隆抗体（NeoMarkers公司）、即用型免疫组化二步法染色试剂盒（福州迈新KIT-9801）。RT-PCR试剂RT试剂盒（上海生工生物技术服务有限公司）PCR试剂盒（上海生工生物技术服务有限公司）100bpDNAladder（华美生物工程公司）PTEN引物（上海生工生物技术服务有限公司）内参GAPDH引物（上海生工生物技术服务有限公司）1)动物实验2)常规切片制作3)HE染色及镜下观察4)免疫组织化学染色检测IL-2R阳性细胞5)RT-PCR检测PTEN表达6)统计分析40只正常雄性SD大鼠，体重100—120g。大鼠置普通级动物实验室饲养，标准饲料喂养及自由饮水，气温20～25℃，湿度为50-60%，2-3只/笼实验分组①正常对照组(G1)②单纯诱癌组(G2)③诱癌加槐耳清膏组(G3)④诱癌九周后槐耳清膏组(G4)④诱癌九周后IL-2组(G5)生理盐水DENADENA+九周后槐耳清膏DENA+九周后IL-2DENA+槐耳清膏DENA灌胃，70mg/kg，每周一次，连续用药15周后停药免疫组化二步法抗原修复：柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）煮沸20minIL-2Rα链单克隆抗体（工作浓度：1︰400）37℃孵育30min，4℃过夜捷达形态分析系统计数IL-2R阳性细胞数PCR执行程序：94℃，2min→94℃，40秒（变性）↙32次↖56℃，40s→72℃，40s→72℃，5min→4℃（复性）（延伸）（总延伸）第10个循环结束后（停留在72℃，提前10秒）暂停，PCR反应体系中加入内参GAPDH引物2.0μl后同管扩增。PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳四星凝胶图像分析系统测定条带密度PTEN的相对表达量=(LP-LB)/(LG-LB)LPPTEN条带密度LGGAPDH条带密度LB背景密度Stata6.0统计软件多组等级资料秩和检验（Kruskal-Wallis法）率的比较卡方检验两样本均数的比较t检验多个样本均数的比较单因素方差分析两变量依存关系直线相关分析检验水准α＝0.05结果1病理观察2免疫组化结果观察3RT-PCR检测PTEN表达4比较IL-2R阳性细胞数与PTEN相对表达量的关系1)各组大鼠肝脏病理观察2)各组鼠肝组织正常、不典型增生与癌形成的比较3)各组癌形成率的比较正常对照组，HE染色×250单纯诱癌组，癌形成伴有明显坏死HE染色×250诱癌加槐耳清膏组，不典型增生结节HE染色×250诱癌加九周后槐耳清膏组卵圆细胞增生HE染色×250诱癌加九周后IL-2组以透明细胞为主的增生伴癌结节形成HE染色×250组别（G）例数正常（％）不典型增生（％）癌形成（%）188（100）0（0）0（0）260（0）1（16.7）5（83.3）364（66.6）1（16.7）1（16.7）470（0）5（71.4）2（28.6）570（0）5（71.4）2（28.6）合计3412（35.3）12（35.3）10（29.4）各组中组织切片正常、不典型增生与癌形成的比较020406080100120G1G2G3G4G5正常不典型增生癌形成百分率（％）组别秩和检验：χ2=20.053（p＝0.0005）组间比较各组癌形成率（卡方检验）G1234-------|---------------------------------------------------------------------2|10.370|0.001|3|1.4365.333|0.2310.021|4|2.6373.8990.258|0.1040.0480.612|5|2.6373.8990.2580.000|0.1040.0480.6121.0001)IL-2R阳性细胞的特征与分布2)各组大鼠肝脏中IL-2R阳性细胞数的比较3)诱癌各组无癌形成病例与癌形成病例中IL-2R阳性细胞数的比较单纯诱癌组肝癌中IL-2R阳性表达于淋巴细胞膜及胞浆免疫组化二步法×500诱癌加槐耳清膏组肝组织中IL-2R阳性表达于淋巴细胞膜及胞浆免疫组化二步法×500F＝17.57，（p＝0.00）051015202530354045G1G2G3G4G5组别IL-2R阳性细胞数各组大鼠肝脏中IL-2R阳性细胞数的比较（单因素方差分析）G1234-----|---------------------------------------------------------------------2|0.975|1.000|3|20.30819.333|0.0200.048|4|19.76118.786-0.548|0.0180.0451.000|5|38.64637.67118.33818.886|0.0000.0000.0530.033组间比较各组肝脏中IL-2R阳性细胞数诱癌各组无癌形成病例与癌形成病例中IL-2R阳性细胞数的比较（t检验）IL-2R阳性细胞数IL-2R阳性细胞数213.6?.052.0?.8(p=0.16)3522.6?.4116.6?.0(p=0.44)4524.1?1.4213.6?.0(p=0.28)5548.4?4.4219.0?.7(p=0.04)组别(G)无癌形成癌形成P值例数例数sxsx0102030405060G2G3G4G5无癌形成癌形成IL-2R阳性细胞数组别1)PTEN阳性表达2)各组大鼠肝脏PTEN相对表达量的比较3)诱癌各组无癌形成病例与癌形成病例中PTEN相对表达量的比较PTEN阳性表达正常对照组PCR产物电泳检测结果500bp578bp(PTEN)452bp(GAPDH)单纯诱癌组PCR产物电泳检测结果500bp578bp(PTEN)452bp(GAPDH)500bp578bp(PTEN)452bp(GAPDH)诱癌加槐耳清膏组PCR产物电泳检测结果诱癌加九周后槐耳清膏组PCR产物电泳检测结果诱癌加九周后IL-2组PCR产物电泳检测结果500bp500bp578bp(PTEN)578bp(PTEN)452bp(GAPDH)452bp(GAPDH)各组大鼠肝脏PTEN相对表达量的比较（单因素方差分析）F=10.16,（p=0.00）00.511.522.5G1G2G3G4G5PTEN相对表达量组别G1234-----|-----------------------------------------------------------2|-1.749|0.000|3|-0.7061.044|0.2210.038|4|-0.9730.776-0.268|0.0290.1690.933|5|-1.1210.628-0.416-0.148|0.0080.3580.7370.991组间比较各组肝脏肝脏PTEN相对表达量诱癌各组无癌形成病例与癌形成病例中PTEN相对表达量的比较（t检验）PTEN相对表达量PTEN相对表达量211.25±0.050.18±0.33(p=0.04)351.44±0.4311.21±0.0(p=0.66)451.47±0.2420.29±0.41(p=0.03)551.26±0.6320.29±0.41(p=0.11)组别(G)无癌形成癌形成P值例数例数sx?sx?00.20.40.60.811.21.41.6G2G3G4G5无癌形成癌形成PTEN相对表达量组别G2、G4、G5组PTEN表达缺失病例与PTEN表达病例的IL-2R阳性细胞数的比较（t检验）IL-2R阳性细胞数IL-2R阳性细胞数231.5±0.633.1±0.5(p=0.03)4112.2±0.0622.6±10.8(p=0.42)5115.0±0.0644.1±16.5(p=0.16)组别(G)PTEN表达缺失PTEN表达P值例数例数sxsx05101520253035404550G2G4G5PTEN表达缺失PTEN表达IL-2R阳性细胞数组别诱癌各组IL-2R阳性细胞数与PTEN相对表达量的关系（直线相关分析）yx167.802.24432PTEN相对表达量IL-2R阳性细胞数相关系数r=0.51,p=0.006讨论1槐耳的抑癌作用2IL-2的抑癌作用3槐耳与IL-2抑癌作用的比较唐《新修本草》中记载：其味苦辛平、无毒，有“治风”、“破血”、“益力”之功效1977年上海市肿瘤医院的记载，青岛的一名晚期肝癌患者，服用槐耳子实体泡制的水，竟奇迹般的治愈了肝癌肝癌形成之初，应用槐耳清膏能有效地抑制肝癌的形成肝癌形成过程中，应用槐耳清膏对肝癌也有显著的抑制作用病理观察槐耳能够增加肝内IL-2R阳性细胞数免疫组化结果观察无癌与癌形成病例中IL-2R阳性细胞数比较槐耳增加肝脏IL-2R阳性细胞的作用不受癌形成的影响肿瘤早期使用槐耳清膏可能通过维持抑癌基因PTEN表达水平来发挥抑癌作用。随着癌形成的进展，槐耳对抑癌基因的影响作用减少大鼠肝脏PTEN相对表达量研究槐耳清膏一方面能激活IL-2R阳性细胞，发挥细胞免疫的抑癌作用，另一方面维持抑癌基因PTEN的表达而达到抑癌的目的PTEN表达与IL-2R阳性细胞数的关系IL-2肿瘤特异性CTL肿瘤细胞+渗透性细胞溶解诱导细胞凋亡肿瘤细胞IL-2能有效地抑制肝癌的形成病理观察IL-2能够有效地激活肝内IL-2R阳性细胞，其作用要强于槐耳免疫组化结果观察当体内有肝癌形成时，IL-2激活体内IL-2R阳性细胞的作用减弱无癌与癌形成病例中IL-2R阳性细胞数比较IL-2抑癌的作用机制并不通过影响PTEN来实现大鼠肝脏PTEN相对表达量研究槐耳与IL-2均能激活肝脏内的IL-2R阳性细胞，且IL-2激活肝内IL-2R阳性细胞的作用要强于槐耳当体内癌已形成时，槐耳激活IL-2R阳性细胞的作用不受影响，而IL-2的作用显著下降。槐耳还可以在肿瘤形成早期增强非特异性的免疫反应槐耳还能抑制PTEN的失活，在基因水平发挥抑癌作用的。而IL-2却没有显示出对PTEN表达有显著的影响IL-2在临床治疗中的疗效并不十分令人满意，因其严重的剂量依赖毒性，使用低剂量的IL-2在临床治疗黑素瘤时效果令人失望。大剂量使用IL-2时可引起毛细血管渗漏综合症等不良反应，以及发热、疲乏等副作用。槐耳作为一种纯天然药物，其毒副作用未见报道，疗效将优于IL-2。结论1、槐耳清膏通过增加肝内IL-2R阳性细胞数，调节机体内环境的免疫功能，增强特异性和非特异性抗肿瘤免疫，能够有效的抑制肝癌形成，还能通过维持肝内抑癌基因PTEN的表达水平发挥抑癌作用，说明槐耳的抑癌作用是通过多种机制、多条途径来实现的。2、IL-2通过增加肝内IL-2R阳性细胞数，增强机体特异性细胞免疫，能够有效