GB 31656.14-2022 食品安全国家标准 水产品中27种性激素残留量的测定 液相色谱-串联

中华人民共和国国家卫生健康委员会食品安全国家标准水产品中27种性激素残留量的测定液相色谱-串联质谱法20中华人民共和国国家标准备案号：XXXX-XXXXＩＣＳ67.120.30X31656.14—2022Nationalfoodsafetystandard—Determinationof27sexhormonesresiduesinfisheryproductsbyliquidchromatography-tandemmassspectrometricGB20220920发布－－20230201－－实施发布国家市场监督管理总局中华人民共和国农业农村部CCSGB３１６５６􀆰１４—２０２２前　　言本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定起草.本文件系首次发布.ⅠGB３１６５６􀆰１４—２０２２食品安全国家标准水产品中２７种性激素残留量的测定　液相色谱Ｇ串联质谱法１　范围本文件规定了水产品中２７种性激素残留量检测的制样和液相色谱Ｇ串联质谱测定方法.本文件适用于鱼、虾和蟹可食部分中己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、己烷雌酚、雌二醇、雌三醇、炔雌醇、苯甲酸雌二醇、群勃龙、诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、炔诺酮、美雄酮、甲基睾酮、康力龙、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、孕酮、２１αＧ羟基孕酮、１７αＧ羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲羟孕酮和左炔诺孕酮残留量的测定.２　规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法GB/T３０８９１—２０１４　水产品抽样规范３　术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义.４　原理试样中残留的性激素用乙酸乙酯Ｇ甲基叔丁基醚混合溶剂和乙酸乙酯依次提取,提取液经浓缩、C１８固相萃取柱净化,用液相色谱Ｇ串联质谱仪测定,内标法定量.５　试剂与材料以下所用的试剂,除特别注明外均为分析纯;水为符合GB/T６６８２规定的一级水.５􀆰１　试剂５􀆰１􀆰１　甲醇(CH３OH):色谱纯.５􀆰１􀆰２　正己烷(C６H１４):色谱纯.５􀆰１􀆰３　甲基叔丁基醚(C５H１２O):色谱纯.５􀆰１􀆰４　乙酸乙酯(C４H８O２):色谱纯.５􀆰１􀆰５　冰乙酸(CH３COOH).５􀆰１􀆰６　三水乙酸钠(C２H３NaO２􀅰３H２O).５􀆰１􀆰７　氨水(NH３􀅰H２O).５􀆰２　溶液配制５􀆰２􀆰１　乙酸Ｇ乙酸钠缓冲溶液:取三水乙酸钠２１􀆰５g、冰乙酸２􀆰６mL,加水适量使溶解并稀释至５００mL,混匀.５􀆰２􀆰２　０􀆰０２％氨水:取氨水１００μL于５００mL水中,混匀.临用前配制.５􀆰２􀆰３　乙酸乙酯Ｇ甲基叔丁基醚溶液:取乙酸乙酯和甲基叔丁基醚等体积混合.５􀆰３　标准品５􀆰３􀆰１　性激素:己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、己烷雌酚、雌二醇、雌三醇、炔雌醇、苯甲酸雌二醇、群勃龙、１GB３１６５６􀆰１４—２０２２诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、炔诺酮、美雄酮、甲基睾酮、康力龙、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、孕酮、２１αＧ羟基孕酮、１７αＧ羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲羟孕酮和左炔诺孕酮:含量≥９７％,具体见附录A.５􀆰３􀆰２　内标:己烯雌酚ＧD８、雌酮ＧD２、雌二醇Ｇ１３C２、甲基睾酮ＧD３、孕酮ＧD９、左炔诺孕酮ＧD６和甲羟孕酮ＧD３:含量≥９７％,具体见附录A.５􀆰４　标准溶液制备５􀆰４􀆰１　标准储备液:取性激素类标准品各１０mg,精密称定,分别用甲醇适量使溶解并定容于１００mL棕色容量瓶,配制成浓度均为１００μg/mL的标准储备液.－１８℃以下保存,有效期１年.５􀆰４􀆰２　混合标准中间液:准确量取各标准储备液适量,于１００mL棕色容量瓶,用甲醇稀释配制成己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、群勃龙、诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、美雄酮、甲基睾酮、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、孕酮、２１αＧ羟基孕酮、１７αＧ羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲羟孕酮浓度均为１μg/mL;己烷雌酚、雌二醇、左炔诺孕酮、炔诺酮、苯甲酸雌二醇和康力龙浓度均为２μg/mL;雌三醇和炔雌醇浓度均为４μg/mL的混合标准中间液.－１８℃以下保存,有效期６个月.５􀆰４􀆰３　混合标准工作液:准确量取混合标准中间液１０mL,于５０mL棕色容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配制成己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、群勃龙、诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、美雄酮、甲基睾酮、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、孕酮、２１αＧ羟基孕酮、１７αＧ羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲羟孕酮浓度均为０􀆰２μg/mL;己烷雌酚、雌二醇、左炔诺孕酮、炔诺酮、苯甲酸雌二醇和康力龙浓度均为０􀆰４μg/mL;雌三醇和炔雌醇浓度均为０􀆰８μg/mL的混合标准工作液.－１８℃以下保存,有效期３个月.５􀆰４􀆰４　内标标准储备液:取同位素内标物各１０mg,精密称定,分别用甲醇适量使溶解并定容于５０mL棕色容量瓶,配制成浓度为２００μg/mL的内标单标储备溶液.－１８℃以下保存,有效期１年.５􀆰４􀆰５　混合内标工作液:分别准确量取内标储备液适量,于１００mL棕色容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配制成雌二醇Ｇ１３C２浓度为２μg/mL;己烯雌酚ＧD８、雌酮ＧD２、甲基睾酮ＧD３、孕酮ＧD９、甲羟孕酮ＧD３和左炔诺孕酮ＧD６浓度均为１μg/mL的混合内标工作液.－１８℃以下保存,有效期６个月.５􀆰５　材料５􀆰５􀆰１　C１８固相萃取柱:５００mg/３mL,或相当者.５􀆰５􀆰２　微孔尼龙滤膜:０􀆰２２μm.６　仪器和设备６􀆰１　高效液相色谱Ｇ串联质谱仪:配电喷雾离子源(ESI).６􀆰２　分析天平:感量０􀆰００００１g和０􀆰０１g.６􀆰３　高速离心机:１００００r/min.６􀆰４　涡旋混合器.６􀆰５　均质机.６􀆰６　旋转蒸发仪.６􀆰７　固相萃取装置.６􀆰８　梨形瓶:１００mL.６􀆰９　超声波清洗器.６􀆰１０　塑料离心管:１０mL和５０mL.７　试样的制备与保存７􀆰１　试样的制备按GB/T３０８９１—２０１４附录B的要求制样.２GB３１６５６􀆰１４—２０２２a)　取均质的供试样品,作为供试试样;b)　取均质的空白样品,作为空白试样;c)　取均质的空白样品,添加适宜浓度的标准溶液,作为空白添加试样.７􀆰２　试样的保存－１８℃以下保存.８　测定步骤８􀆰１　提取取试料５g(准确至±０􀆰０５g),于５０mL离心管中,准确加入３０μL混合内标工作液和乙酸Ｇ乙酸钠缓冲液１０mL,涡旋３０s,加乙酸乙酯Ｇ甲基叔丁基醚溶液１０mL,涡旋１min,超声１０min,涡旋混合１min,于８０００r/min离心８min,取上层有机相于１００mL梨形瓶;残渣用乙酸乙酯１０mL重复提取１次,有机相合并至梨形瓶中,于３５℃水浴旋转蒸发至干.对蒸干后有油脂残留的样品,用氮气或空气将残留在油脂中的乙酸乙酯吹除干净.加入正己烷７mL溶解残留物,备用.８􀆰２　净化取C１８固相萃取柱,依次用甲醇、正己烷各５mL活化.取备用液,过柱,控制流速不超过１滴/s;用正己烷１０mL淋洗,吹干;用甲醇１０mL洗脱,收集洗脱液,于４０℃水浴旋转蒸发至干.准确加入甲醇０􀆰８５mL,涡旋混合１min,再准确加入水０􀆰１５mL,混合３０s,８０００r/min,离心６min,上清液用０􀆰２２μm尼龙滤膜过滤,供液相色谱Ｇ串联质谱测定.８􀆰３　基质匹配标准工作曲线的制备分别取１０μL、２５μL、５０μL、１００μL、２５０μL、５００μL混合标准工作溶液于５mL玻璃离心管中,分别加混合内标工作液３０μL,吹干,加入经７􀆰１和７􀆰２步骤处理所得的基质空白溶液１􀆰０mL,混合１min,配制成激素浓度为２ng/mL~４００ng/mL系列基质匹配标准工作液,上机测定.以标准物质特征离子色谱峰的峰面积与内标物特征离子色谱峰的峰面积比值为纵坐标、相应的浓度为横坐标,绘制基质标准工作曲线.求回归方程和相关系数.８􀆰４　测定８􀆰４􀆰１　液相色谱参考条件a)　色谱柱:XBridgeShieldRP１８柱(４􀆰６mm×１５０mm,５μm),或相当者;b)　流速:０􀆰４mL/min;c)　进样量:２０μL;d)　柱温:２５℃;e)　流动相A为甲醇;流动相B为０􀆰０２％氨水,梯度洗脱程序见表１.表１　梯度洗脱条件时间,minA,％B,％０􀆰０８５１５８􀆰０９０１０１５􀆰０９０１０１５􀆰１９７３２０􀆰０９７３２０􀆰１８５１５２５􀆰０８５１５８􀆰４􀆰２　质谱参考条件a)　离子源:ESI;b)　喷雾电压:３􀆰０kV;c)　离子传输管温度:３５０℃;３GB３１６５６􀆰１４—２０２２d)　鞘气流速:１３􀆰３L/min;e)　辅助气流速:３􀆰３L/min;f)　碰撞气压:０􀆰１９９５Pa;g)　检测方式:多反应监测(MRM),２７种激素及内标物多反应监测母离子、子离子、碰撞能量和扫描方式见表２.表２　２７种性激素及内标物母离子、子离子、碰撞能量和扫描方式序号化合物名称扫描方式母离子m/z锥孔电压V子离子m/z碰撞能量eV内标物１己二烯雌酚ESI－２６４􀆰９８７２己烯雌酚ESI－２６６􀆰９８７２３６􀆰１２９２４９􀆰１∗２９２３７􀆰１３０２５１􀆰１∗２８己烯雌酚ＧD８３己烷雌酚ESI－２６９􀆰２８７４雌酮ESI－２６８􀆰９８７１３４􀆰１１９１１９􀆰１∗４８１８３􀆰１４５１４５􀆰１∗４０雌酮ＧD２５雌二醇ESI－２７１􀆰２８７６雌三醇ESI－２８７􀆰１８７７炔雌醇ESI－２９５􀆰１８７１８３􀆰２∗４２１４５􀆰１４３１４５􀆰１４６１７１􀆰１∗４０１５９􀆰１３５１４５􀆰１∗４８雌二醇Ｇ１３C２８苯甲酸雌二醇ESI＋３７７􀆰２１２６９１７Ｇα羟基孕酮ESI＋３３１􀆰２１２６１０２１Ｇα羟基孕酮ESI＋３３１􀆰２１２６１１醋酸甲羟孕酮ESI＋３８７􀆰２１２６１２醋酸氯地孕酮ESI＋４０５􀆰２１２６１３醋酸甲地孕酮ESI＋３８５􀆰２１２６１４甲羟孕酮ESI＋３４５􀆰３１２６１５炔诺酮ESI＋２９９􀆰２８７１６康力龙ESI＋３２９􀆰４１２６１３５􀆰１１０１０５􀆰１∗２８１０９􀆰１２３９７􀆰１∗２３１０９􀆰１２３９７􀆰１∗２３１２３􀆰１２９３２７􀆰３∗１１３０９􀆰３１４３０１􀆰２∗１９２６７􀆰２１８２２４􀆰２∗２３９７􀆰１２９１２３􀆰１∗２３２３１􀆰２１７１０９􀆰１∗２６１２１􀆰１３６８１􀆰１∗４３甲羟孕酮ＧD３１７孕酮ESI＋３１５􀆰０８７１０９􀆰１２８９７􀆰１∗２２孕酮ＧD９１８左炔诺孕酮ESI＋３１３􀆰２８７１０９􀆰１３０２４５􀆰２∗１８左炔诺孕酮ＧD６１９诺龙ESI＋２７５􀆰２８７２０苯丙酸诺龙ESI＋４０７􀆰２１２６２１睾酮ESI＋２８９􀆰２８７２２勃地酮ESI＋２８７􀆰２８７２５７􀆰２１３２３９􀆰２∗１６２５７􀆰２∗１６１０５􀆰２２８９７􀆰２２０１０９􀆰１∗２７１２１􀆰１２２１３５􀆰２∗１３甲基睾酮ＧD３４GB３１６５６􀆰１４—２０２２表２(续)序号化合物名称扫描方式母离子m/z锥孔电压V子离子m/z碰撞能量eV内标物２３群勃龙ESI＋２７１􀆰１８７２４甲基睾酮ESI＋３０３􀆰１８７２５雄烯二酮ESI＋２８７􀆰２８７２６美雄酮ESI＋３０１􀆰２８７２７丙酸睾酮ESI＋３４５􀆰２１２６１９９􀆰１１８２５３􀆰２∗２３１０９􀆰１２６９７􀆰１∗２８１０９􀆰１２４９７􀆰１∗２０１４９􀆰２１２１２１􀆰１∗２３１０９􀆰１２９９７􀆰１∗３０甲基睾酮ＧD３２８甲基睾酮ＧD３ESI＋３０６􀆰２８７１０９􀆰２∗３０２