GB 5413.20-2022 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定

书书书中华人民共和国国家标准犌犅５４１３．２０—２０２２食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定２０２２０６３０发布２０２２１２３０实施中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局发布书书书犌犅５４１３．２０—２０２２Ⅰ　　　　前　　言　　本标准代替ＧＢ５４１３．２０—２０１３《食品安全国家标准　婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定》。本标准与ＧＢ５４１３．２０—２０１３相比，主要变化如下：———删除了第二法雷氏盐分光光度法，增加了离子色谱法作为第二法；———增加了液相色谱串联质谱法作为第三法。犌犅５４１３．２０—２０２２１　　　　食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定１　范围本标准规定了婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定方法。本标准适用于婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定。第一法　酶比色法２　原理试样经酸水解，再经酶作用后与显色剂反应生成有色物质，在一定浓度范围内，其颜色的深浅与胆碱含量成正比，外标法定量。３　试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的三级水。３．１　试剂３．１．１　三羟甲基氨基甲烷［（ＣＨ２ＯＨ）３ＣＮＨ２］。３．１．２　苯酚（Ｃ６Ｈ５ＯＨ）。３．１．３　浓盐酸（ＨＣｌ）。３．１．４　氢氧化钠（ＮａＯＨ）。３．１．５　胆碱氧化酶：≥１０Ｕ／ｍｇ，置于－２０℃保存。３．１．６　过氧化物酶：≥２５０Ｕ／ｍｇ，置于２℃～８℃保存。３．１．７　４氨基安替比林（Ｃ１１Ｈ１３Ｎ３Ｏ）。３．１．８　磷脂酶Ｄ：≥６０Ｕ／ｍｇ，置于－２０℃保存。３．２　试剂配制３．２．１　盐酸溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）：量取８５ｍＬ浓盐酸注入约９００ｍＬ水中，稀释至１０００ｍＬ。３．２．２　盐酸溶液（３ｍｏｌ／Ｌ）：量取２５０ｍＬ浓盐酸注入约６００ｍＬ水中，稀释至１０００ｍＬ。３．２．３　三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液（Ｔｒｉｓ）（０．０５ｍｏｌ／Ｌ）：准确称取６．０５７ｇ三羟甲基氨基甲烷溶于５００ｍＬ水中，用盐酸溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）调ｐＨ至８．０±０．２，再用水定容至１０００ｍＬ。此溶液在４℃冰箱中可保存１个月。３．２．４　显色剂：取１２０Ｕ的胆碱氧化酶、２８０Ｕ的过氧化物酶、１００Ｕ的磷脂酶Ｄ、１５ｍｇ４氨基安替比林和５０ｍｇ苯酚置于１００ｍＬ的容量瓶中，用０．０５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ缓冲溶液溶解并定容。临用现配。３．２．５　氢氧化钠溶液（５００ｇ／Ｌ）：称取５００ｇ氢氧化钠，溶于水并稀释至１０００ｍＬ，采用塑料容器储存。犌犅５４１３．２０—２０２２２　　　　３．３　标准品胆碱酒石酸氢盐标准品（Ｃ９Ｈ１９ＮＯ７，相对分子质量：２５３．２５，ＣＡＳ号：８７６７２）：纯度≥９９％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。３．４　标准溶液配制３．４．１　胆碱（以胆碱氢氧化物计，相对分子质量１２１．１８）标准储备溶液（２５００ｍｇ／Ｌ）：准确称取在１０２℃±２℃烘至恒重的胆碱酒石酸氢盐５２２．５ｍｇ，用水溶解并转移至１００ｍＬ容量瓶中定容，混匀。４℃以下避光保存，有效期３个月。３．４．２　胆碱标准工作溶液（２５０ｍｇ／Ｌ）：吸取１０．０ｍＬ胆碱标准储备溶液于１００ｍＬ容量瓶中，用水定容，混匀，４℃以下避光保存，有效期１个月。３．５　材料３．５．１　０．４５μｍ水性滤膜针头滤器。３．５．２　注射器：５ｍＬ或相当者。４　仪器和设备４．１　分析天平：感量分别为０．１ｍｇ和０．００１ｇ。４．２　恒温水浴装置：温度可控制在７０℃±２℃和３７℃±２℃。４．３　ｐＨ计：精度０．０１。４．４　分光光度计。５　分析步骤５．１　样品前处理５．１．１　样品预处理准确称取２０ｇ（精确至０．００１ｇ）混合均匀的液态试样于１００ｍＬ锥形瓶中，加入３ｍｏｌ／Ｌ的盐酸溶液１０ｍＬ，加塞混匀。准确称取５ｇ（精确至０．００１ｇ）混合均匀的半固态或固态试样于１００ｍＬ锥形瓶中，加入１ｍｏｌ／Ｌ的盐酸溶液３０ｍＬ，加塞混匀。５．１．２　水解将装有试样的容器放在７０℃±２℃水浴中，放置３ｈ（每隔３０ｍｉｎ振摇一次），冷却至室温。用氢氧化钠溶液（５００ｇ／Ｌ）调ｐＨ至３．５～４．０，转入５０ｍＬ容量瓶中，用水定容至刻度。５．１．３　过滤用滤纸过滤水解液，若滤液不澄清，用０．４５μｍ水性滤膜针头滤器再次过滤。收集滤液待测。５．２　测定５．２．１　标准曲线的制作分别吸取２．００ｍＬ、４．００ｍＬ、６．００ｍＬ、８．００ｍＬ、１０．００ｍＬ胆碱标准工作溶液（２５０ｍｇ／Ｌ）于１０ｍＬ犌犅５４１３．２０—２０２２３　　　　的容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，配制成浓度分别为５０．０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、２５０ｍｇ／Ｌ的标准系列工作溶液。准备６支比色管，一个比色管用作试剂空白（Ａ），加入１００μＬ水，另５支比色管对应加入标准系列工作溶液各１００μＬ，再分别加入３．００ｍＬ显色剂，混匀，把比色管置于３７℃±２℃水浴中保温反应１５ｍｉｎ。５．２．２　试样准备准备２支比色管（Ｂ，Ｃ），均加入待分析溶液１００μＬ，比色管Ｂ加入３．００ｍＬ水，比色管Ｃ加入３．００ｍＬ显色剂，混匀，把比色管置于３７℃±２℃水浴中保温反应１５ｍｉｎ。５．２．３　比色测定将标准系列工作溶液及试样从水浴中取出，冷却至室温。在波长５０５ｎｍ处，用水作空白，用１ｃｍ微量比色皿测定吸光值。以胆碱标准溶液的浓度为横坐标，以标准溶液的吸光值减去试剂空白（比色管Ａ）的吸光值为纵坐标，制作标准曲线。６　分析结果的表述６．１　净吸光值的计算通常配制的试剂会产生轻微颜色，且由于水解作用滤液也不是无色的，为了除去这些干扰因素，必须从总吸光值中减去各自的空白值（比色管Ａ和比色管Ｂ）。试样净吸光值按式（１）计算：犃＝犃ｔ－犃ｂ－犃ｅ…………………………（１）　　式中：犃———试样净吸光值；犃ｔ———总吸光值（比色管Ｃ））；犃ｂ———试剂吸光值（比色管Ａ）；犃ｅ———滤液吸光值（比色管Ｂ）。犃ｂ和犃ｅ不应大于总吸光值的２０％。６．２　胆碱含量的计算试样中的胆碱（以胆碱氢氧化物计）的含量按式（２）计算：犡＝犮×犞×犳×１００犿×１０００…………………………（２）　　式中：犡　———试样中的胆碱（以胆碱氢氧化物计）含量，单位为毫克每百克（ｍｇ／１００ｇ）；犮———自标准曲线上查得净吸光值对应的胆碱的浓度，单位为毫克每升（ｍｇ／Ｌ）；犞———水解液被稀释的体积（水解液定容体积，通常为５０ｍＬ），单位为毫升（ｍＬ）；犳———稀释倍数；１００———换算系数；犿———试样的质量，单位为克（ｇ）；１０００———换算系数。计算结果保留三位有效数字。犌犅５４１３．２０—２０２２４　　　　７　精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１０％。８　其他当固态或半固态试样称样量为５ｇ时，方法的检出限为１ｍｇ／１００ｇ，定量限为３ｍｇ／１００ｇ；当液态试样称样量为２０ｇ时，方法的检出限为０．３ｍｇ／１００ｇ，定量限为０．８ｍｇ／１００ｇ。第二法　离子色谱法９　原理试样经酸水解，固相萃取柱净化后离子色谱分离，电导检测器检测，外标法定量。１０　试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。１０．１　试剂１０．１．１　浓盐酸（ＨＣｌ）。１０．１．２　甲烷磺酸（ＣＨ４Ｏ３Ｓ）：色谱纯。１０．２　试剂配制１０．２．１　盐酸溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）：量取８５ｍＬ浓盐酸注入约９００ｍＬ水中，稀释至１０００ｍＬ。１０．２．２　盐酸溶液（１．７ｍｏｌ／Ｌ）：量取１４５ｍＬ浓盐酸注入约８００ｍＬ水中，稀释至１０００ｍＬ。１０．２．３　甲烷磺酸溶液（６ｍｍｏｌ／Ｌ）：吸取０．３９０ｍＬ甲烷磺酸并稀释至１０００ｍＬ。１０．２．４　甲烷磺酸溶液（１５ｍｍｏｌ／Ｌ）：吸取０．９７４ｍＬ甲烷磺酸并稀释至１０００ｍＬ。１０．２．５　甲烷磺酸溶液（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）：吸取１．６２ｍＬ甲烷磺酸并稀释至１０００ｍＬ。１０．３　标准品胆碱酒石酸氢盐标准品（Ｃ９Ｈ１９ＮＯ７，相对分子质量：２５３．２５，ＣＡＳ号：８７６７２）：纯度≥９９％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。１０．４　标准溶液配制１０．４．１　胆碱（以胆碱氢氧化物计，相对分子质量１２１．１８）标准储备液（２５００ｍｇ／Ｌ）：准确称取在１０２℃±２℃烘至恒重的胆碱酒石酸氢盐５２２．５ｍｇ，用水溶解并转移至１００ｍＬ容量瓶中定容，混匀。４℃以下避光保存，有效期３个月。１０．４．２　胆碱标准工作液（１００ｍｇ／Ｌ）：吸取２．０ｍＬ上述胆碱标准储备液于５０ｍＬ容量瓶中，用１５ｍｍｏｌ／Ｌ的甲烷磺酸溶液定容，混匀，４℃以下避光保存，有效期１个月。１０．４．３　胆碱标准系列工作液：分别吸取上述胆碱标准工作液０．２００ｍＬ、０．５００ｍＬ、１．００ｍＬ、２．５０ｍＬ、犌犅５４１３．２０—２０２２５　　　　５．００ｍＬ于一组１００ｍＬ容量瓶中，用１５ｍｍｏｌ／Ｌ的甲烷磺酸溶液定容混匀，配得胆碱浓度为０．２００ｍｇ／Ｌ、０．５００ｍｇ／Ｌ、１．００ｍｇ／Ｌ、２．５０ｍｇ／Ｌ、５．００ｍｇ／Ｌ的标准系列工作液。临用现配。１０．５　材料１０．５．１　０．４５μｍ水性滤膜针头滤器。１０．５．２　净化柱：Ｃ１８固相萃取小柱１．０ｍＬ或相当者。１０．５．３　注射器：５ｍＬ或相当者。１１　仪器和设备１１．１　离子色谱仪（ＩＣ）：配电导检测器。１１．２　分析天平：感量分别为０．１ｍｇ和０．００１ｇ。１１．３　电热恒温水浴装置：温度可控制在７０℃±２℃。１１．４　涡旋混合器。１２　分析步骤１２．１　样品前处理１２．１．１　试样提取１２．１．１．１　液态试样准确称取１０ｇ（精确至０．００１ｇ）混合均匀的液体试样于５０ｍＬ比色管中，加入１．７ｍｏｌ／Ｌ的盐酸溶液１５ｍＬ，加盖，混匀后放入７０℃±２℃水浴中水解３ｈ（每３０ｍｉｎ摇一次）。将水解液冷却至室温，转移至５０ｍＬ容量瓶并用水定容至刻度，混匀待用。１２．１．１．２　半固态或固态试样准确称取２．５ｇ（精确至０．００１ｇ）半固态或固体试样于５０ｍＬ比色管中，加入１ｍｏｌ／Ｌ的盐酸溶液２５ｍＬ，加盖，涡旋至试样溶液中无结块，混匀后放入７０℃±２℃水浴中水解３ｈ（每３０ｍｉｎ摇一次）。将水解液冷却至室温，转移至５０ｍＬ容量瓶并用水定容至刻度，混匀待用。１２．１．２　试样净化Ｃ１８固相萃取小柱（１．０ｍＬ）使用前依次用１０ｍＬ甲醇、１５ｍＬ水通过，静置活化３０ｍｉｎ。用水稀释提取溶液５０倍（可根据试样中胆碱的浓度适当的调整稀释倍数，不得少于１０倍），取稀释后的溶液约１５ｍＬ过０．４５μｍ水性滤膜和Ｃ１８固相萃取小柱（１．０ｍＬ），弃去前３ｍＬ，收集后面洗脱液待测。１２．２　仪器参考条件ａ）　离子色谱柱参数：装有羧基的高容量阳离子交换柱，如ＩｏｎＰａｃＣＳ１２Ａ４ｍｍ×２５０ｍｍ（带ＩｏｎＰａｃＣＧ１２Ａ型保护柱４ｍｍ×５０ｍｍ）或ＩｏｎＰａｃＣＳ１９４ｍｍ×２５０ｍｍ（带ＩｏｎＰａｃＣＧ１９型保护柱４ｍｍ×５０ｍｍ），或等效色谱柱。ｂ）　ＩｏｎＰａｃＣＳ１２Ａ等度淋洗：１５ｍｍｏｌ／Ｌ甲烷磺酸溶液等度淋洗，采集时间２５ｍｉｎ。ＩｏｎＰａｃＣＳ１９等度淋洗：６ｍｍｏｌ／Ｌ甲烷磺酸溶液等度淋洗，采集时间２５ｍｉｎ。犌犅５４１３．２０—２０２２６　　　　ｃ）　流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ。ｄ）　电导检测器：配抑制器或等效抑制装置。ｅ）　进样量：１００μＬ。１２．３　标准曲线的制作将标准系列工作液分别注入离子色谱仪，测定相应的电导率峰面积或峰高。以标准系列工作液的浓度为横坐标，以电导率峰面积或峰高为纵坐标，绘制标准曲线。胆碱标准溶液的离子色谱图参见附录Ａ。１２．４　试样溶液的测定将试样溶液注入离子色谱仪中，得到相应的电导率峰面积或峰高，根据标准曲线得到待测溶液中胆碱的浓度。１２．５　空白试验不称取试样，按照１２．１的步骤做空白试验。应确认不含有干扰待测组分的物质。１３　分析结果的表述试样中胆碱（以胆碱氢氧化物计）的含量按式（３）计算：犡＝犮×犞×犳×１００犿×１０００…………………………（３）　　式