GBT 39670-2020 宠物饲料中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

书书书犐犆犛６５．１２０犅４６!#$%&’’()*犌犅／犜３９６７０—２０２０!#$%&’()*+,-./012　34567896:犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狀犻狋狉狅犳狌狉犪狀犿犲狋犪犫狅犾犻狋犲狊犻狀狆犲狋犳犲犲犱狊—犔犻狇狌犻犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔狋犪狀犱犲犿犿犪狊狊狊狆犲犮狋狉狅犿犲狋狉狔２０２０１２１４;２０２１０７０１=’(+,-./012’()*3/0456;书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（ＳＡＣ／ＴＣ７６）提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国南京海关、中华人民共和国淮安海关、江苏海企长城股份有限公司、淮阴师范学院。本标准主要起草人：蒋原、何健、魏云计、宦海霞、朱臻怡、冯民、王远见、柯家法、张扬、张科、张敬友。Ⅰ犌犅／犜３９６７０—２０２０宠物饲料中硝基呋喃类代谢物残留量的测定　液相色谱串联质谱法１　范围本标准规定了宠物饲料中硝基呋喃类代谢物（３氨基２唑酮、５吗啉甲基３氨基２唑烷基酮、１氨基乙内酰脲、氨基脲）残留量的液相色谱串联质谱测定方法。本标准适用于以动物源性成分为主要原料制成的宠物饲料中硝基呋喃类代谢物（３氨基２唑酮、５吗啉甲基３氨基２唑烷基酮、１氨基乙内酰脲、氨基脲）残留量的测定。本标准的检出限为０．２５μｇ／ｋｇ，定量限为０．５μｇ／ｋｇ。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ／Ｔ２０１９５　动物饲料　试样的制备３　缩略语下列缩略语适用于本文件。ＡＯＺ：３氨基２唑酮（３ａｍｉｎｏ２ｏｘａｌｉｄｉｎｏｎｅ）ＡＭＯＺ：５吗啉甲基３氨基２唑烷基酮（５ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｍｅｔｈｙｌ３ａｍｉｎｏ２ｏｘａｌｉｄｉｎｏｎｅ）ＡＨＤ：１氨基乙内酰脲（１ａｍｉｎｏｈｙｄａｎｔｏｉｎ）ＳＥＭ：氨基脲（ｓｅｍｉｃａｒｂａｚｉｄｅ）４　原理试样经三氯乙酸沉淀蛋白质，游离出硝基呋喃类代谢物，在避光条件下用邻硝基苯甲醛衍生化、乙酸乙酯提取后，用液相色谱串联质谱仪检测，同位素内标法定量。５　试剂或材料除非另有规定外，仅使用分析纯试剂。５．１　水：ＧＢ／Ｔ６６８２，一级。５．２　乙腈：色谱纯。５．３　乙酸铵：色谱纯。５．４　甲酸：色谱纯。５．５　甲醇：色谱纯。５．６　二甲基亚砜。１犌犅／犜３９６７０—２０２０５．７　正己烷。５．８　乙酸乙酯。５．９　邻硝基苯甲醛。５．１０　三氯乙酸溶液（２００ｇ／Ｌ）：称取２０．０ｇ三氯乙酸溶解于１００ｍＬ水中。５．１１　邻硝基苯甲醛衍生试剂（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）：称取０．０３７８ｇ邻硝基苯甲醛（５．９）溶于５ｍＬ二甲基亚砜（５．６）中。现用现配。５．１２　磷酸氢二钾溶液（１．０ｍｏｌ／Ｌ）：称取１７．４ｇ无水磷酸氢二钾溶于１００ｍＬ水中。５．１３　乙酸铵缓冲液（０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）：称取０．０３８５ｇ乙酸铵（５．３）溶于５００ｍＬ水中，加入２００μＬ甲酸（５．４），用水定容至１０００ｍＬ。５．１４　样品溶解液：分别量取１０ｍＬ乙腈（５．２）和９０ｍＬ乙酸铵缓冲液（５．１３），混合均匀。５．１５　乙腈饱和正己烷：量取８０ｍＬ正己烷（５．７）于１００ｍＬ分液漏斗中，加入适量乙腈后，剧烈振摇，静置分层后，弃去乙腈层。５．１６　标准品：ＡＯＺ（ＣＡＳ：８０６５９）、ＡＭＯＺ（ＣＡＳ：４３０５６６３９）、ＡＨＤ·ＨＣｌ（ＣＡＳ：２８２７５６７）、ＳＥＭ·ＨＣｌ（ＣＡＳ：５６３４１７）。纯度≥９９．０％。５．１７　硝基呋喃类代谢物同位素内标：Ｄ４ＡＯＺ、Ｄ５ＡＭＯＺ、１３Ｃ３ＡＨＤ、１３Ｃ１５Ｎ２ＳＥＭ·ＨＣｌ。纯度≥９９．０％。５．１８　标准储备溶液：分别准确称取适量硝基呋喃类代谢物标准品（５．１６），用甲醇（５．５）溶解定容，配制成浓度约为１．０ｍｇ／ｍＬ的标准储备液。－１８℃以下避光保存，有效期为６个月。５．１９　混合标准中间溶液：分别准确移取标准储备溶液（５．１８）各１ｍＬ于１００ｍＬ容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度约为１０μｇ／ｍＬ的混合中间标准溶液。－１８℃以下避光保存，有效期为３个月。５．２０　混合标准工作溶液：分别准确移取适量的混合标准中间溶液（５．１９）于１０ｍＬ和１００ｍＬ容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度分别为１００ｎｇ／ｍＬ和１０ｎｇ／ｍＬ的混合标准工作溶液。４℃避光保存，有效期为７天。５．２１　同位素内标储备溶液：分别准确称取适量硝基呋喃类代谢物同位素内标（５．１７），用甲醇（５．５）溶解定容，配制成浓度约为１．０ｍｇ／ｍＬ。－１８℃以下避光保存，有效期为６个月。５．２２　同位素内标混合标准中间溶液：分别准确移取同位素内标储备溶液（５．２１）各１ｍＬ于１００ｍＬ容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度约为１０μｇ／ｍＬ的同位素内标混合标准中间溶液。－１８℃以下避光保存，有效期为３个月。５．２３　同位素内标混合标准工作溶液：准确移取同位素内标混合标准中间溶液（５．２２）０．１ｍＬ于１０ｍＬ容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度约为１００ｎｇ／ｍＬ的同位素内标混合标准中间溶液。４℃避光保存，有效期为７天。５．２４　微孔滤膜：０．２２μｍ，有机系。６　仪器设备６．１　液相色谱串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ＥＳＩ）。６．２　分析天平：感量０．０１ｍｇ和０．０１ｇ。６．３　水浴恒温振荡器：３７℃±１℃。６．４　离心机：转速不低于８０００ｒ／ｍｉｎ。６．５　涡旋混匀器。６．６　氮吹仪。２犌犅／犜３９６７０—２０２０７　样品固态样品按ＧＢ／Ｔ２０１９５进行样品制备，高速研磨仪粉碎，转速１００００ｒ／ｍｉｎ以上，过０．４２ｍｍ孔径筛，混匀装于密封容器，备用。半固态样品按ＧＢ／Ｔ２０１９５进行样品制备，用高速均质器均质，转速１２０００ｒ／ｍｉｎ以上，均质后装于密封容器，备用。试样置于－１８℃避光保存。８　试验步骤８．１　衍生平行做两份试验。称取试样２ｇ，准确至０．０１ｇ，置于５０ｍＬ具塞离心管中，准确加入０．０５ｍＬ同位素内标混合标准工作溶液（５．２３），４ｍＬ水（５．１）和２．０ｍＬ三氯乙酸溶液（５．１０），涡旋１ｍｉｎ后，加入１５０μＬ邻硝基苯甲醛衍生试剂（５．１１），在３７℃±１℃水浴中避光振荡水解１６ｈ，冷却，备用。８．２　提取备用液（８．１）用磷酸氢二钾溶液（５．１２）调节ｐＨ至７．０～７．５，加入８ｍＬ乙酸乙酯（５．８），涡旋１ｍｉｎ，于８０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，吸取上清液。残留物再加入８ｍＬ乙酸乙酯重复上述操作，合并上清液，４０℃下氮气吹干，加入１．０ｍＬ样品溶解液（５．１４）充分溶解，再加入１．０ｍＬ乙腈饱和正己烷（５．１５）涡旋，于８０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，吸取下层溶液，过０．２２μｍ滤膜后，待测。８．３　标准曲线的制备准确移取１０ｎｇ／ｍＬ和１００ｎｇ／ｍＬ混合标准工作溶液（５．２０）０．２０ｍＬ、０．１０ｍＬ和０．０５ｍＬ，分别置于５０ｍＬ离心管中，按８．１和８．２进行衍生和提取。８．４　测定８．４．１　液相色谱参考条件色谱柱：Ｃ１８柱，柱长１００ｍｍ，内径２．０ｍｍ，粒径５μｍ，或性能相当者；柱温：３５℃；流速：０．２５ｍＬ／ｍｉｎ；进样量：１０μＬ；流动相：Ａ：乙腈（５．２），Ｂ：乙酸铵缓冲溶液（５．１３），梯度洗脱程序见表１。表１　梯度洗脱程序时间／ｍｉｎＡ／％Ｂ／％０．００１０９０２．５０１０９０６．３０９５５７．５０９５５７．６０１０９０１１．０１０９０３犌犅／犜３９６７０—２０２０８．４．２　质谱参考条件电离方式：电喷雾电离，正离子模式（ＥＳＩ＋）；检测方式：多反应监测（ＭＲＭ）；电喷雾电（ＩＳ）压：５５００Ｖ；离子源温度（ＴＥＭ）：５００℃；气帘气压力（ＣＵＲ）：２０６．８５ｋＰａ（３０ｐｓｉ）；雾化气压力（ＧＳ１）：３４４．７５ｋＰａ（５０ｐｓｉ）；辅助气压力（ＧＳ２）：３４４．７５ｋＰａ（５０ｐｓｉ）；碰撞气压力（ＣＡＤ）：６２．０５５ｋＰａ（９ｐｓｉ）；碰撞室出口电压（ＣＸＰ）：６Ｖ。多反应监测（ＭＲＭ）离子对、驻留时间、去簇电压和碰撞能量见表２。表２　硝基呋喃代谢物及内标的多反应监测（犕犚犕）离子对、驻留时间、去簇电压及碰撞能量的参考值被测物名称监测离子对（犿／狕）驻留时间／ｍｓ去簇电压（ＤＰ）／Ｖ碰撞能量（ＣＥ）／ＶＡＯＺ２３６．０＞１３４．１ａ５０９０１９２３６．０＞１０４．１５０９０３１ＡＭＯＺ３３５．２＞２９１．２ａ５０８７１７３３５．２＞２６２．１５０８７２３ＡＨＤ２４９．１＞１３４．２ａ５０９０１９２４９．１＞１０４．０５０９０３０ＳＥＭ２０９．０＞１６６．３ａ５０８４１５２０９．０＞１９２．２５０８４１６Ｄ４ＡＯＺ２４０．１＞１３４．１５０９０１９Ｄ５ＡＭＯＺ３４０．２＞２９６．０５０９０１８１３Ｃ３ＡＨＤ２５２．０＞１３４．１５０８２１９１３Ｃ１５Ｎ２ＳＥＭ２１２．０＞１６８．１５０８４１４　　ａ为定量离子。８．４．３　标准系列溶液和试样溶液测定在仪器的最佳条件下，分别取标准系列溶液（８．３）和试样溶液（８．２）上机测定。硝基呋喃类代谢物标准溶液的定量离子色谱图参见附录Ａ。８．４．４　定性在相同试验条件下，试样溶液与标准系列溶液中硝基呋喃类代谢物的保留时间相对偏差应在±２．５％之内。根据表２选择的定性离子对，比较试样谱图中硝基呋喃类代谢物定性离子的相对离子丰度与浓度接近的标准系列溶液中对应的定性离子的相对离子丰度，若偏差不超过表３规定的范围，则可判定为样品中存在对应的硝基呋喃类代谢物。４犌犅／犜３９６７０—２０２０表３　定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度／％＞５０＞２０～５０＞１０～２０≤１０最大允许偏差／％±２０±２５±３０±５０８．４．５　定量以硝基呋喃类代谢物的浓度为横坐标，硝基呋喃类代谢物和内标峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线的相关系数应不低于０．９９。试样溶液与标准溶液中硝基呋喃类代谢物的响应值均应在仪器检测的线性范围内，如超出范围，应重新试验或将试样溶液和标准系列溶液做相应稀释后重新测定。９　试验数据处理试样中硝基呋喃类代谢物的含量以质量分数狑计，数值以微克每千克（μｇ／ｋｇ）表示。按式（１）计算：狑＝犃×犃′ｉｓ×ρｓ×ρｉｓ×犞×１０００犃ｉｓ×犃ｓ×ρ′ｉｓ×犿×１０００…………………………（１）　　式中：犃———试样溶液中硝基呋喃类代谢物的峰面积；犃′ｉｓ———标准溶液中硝基呋喃类代谢物同位素内标的峰面积；ρｓ———标准溶液中硝基呋喃类代谢物的质量浓度，单位为纳克每毫升（ｎｇ／ｍＬ）；ρｉｓ———试样溶液中硝基呋喃类代谢物同位素内标的浓度，单位为纳克每毫升（ｎｇ／ｍＬ）；犞———溶解残余物溶液的体积，单位为毫升（ｍＬ）；犃ｉｓ———试样溶液中硝基呋喃类代谢物同位素内标的峰面积；犃ｓ———标准溶液中硝基呋喃类代谢物的峰面积；ρ′ｉｓ———标准溶液中硝基呋喃类代谢物同位素内标的质量浓度，单位为纳克每毫升（ｎｇ／ｍＬ）；犿———试样质量，单位为克（ｇ）。测定结果以平行测定的算术平均值表示，保留３位有效数字。１０　精密度在重复性条件下，两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的１５％。５犌犅／犜３９６７０—２０２０附　录　犃（资料性附录）硝基呋喃类代谢物标准溶液的定量离子色谱图　　硝基呋喃类代谢物标准溶液的定量离子色谱图见图Ａ．１。图犃．１　硝基呋喃类代谢物标准溶液的定量离子色谱图（硝基呋喃代谢物浓度１狀犵／犿犔，硝基呋喃代谢物同位素内标浓度５狀犵／犿犔）６犌犅／犜３９６７０—２０２０图犃．１（续）７犌犅／犜３９６７０—２０２０图犃．１（续）８犌犅／犜３９６７０—２０２