GBT 41185-2021 水生动物病原DNA检测参考物质制备和质量控制规范 质粒

书书书犐犆犛６５．０２０．３０犆犆犛犅４１中华人民共和国国家标准犌犅／犜４１１８５—２０２１水生动物病原犇犖犃检测参考物质制备和质量控制规范　质粒犛狆犲犮犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狆狉犲狆犪狉犪狋犻狅狀犪狀犱狇狌犪犾犻狋狔犮狅狀狋狉狅犾狅犳狉犲犳犲狉犲狀犮犲犿犪狋犲狉犻犪犾狊犳狅狉犇犖犃犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犪狇狌犪狋犻犮犪狀犻犿犪犾狊狆犪狋犺狅犵犲狀—犘犾犪狊犿犻犱　２０２１１２３１发布２０２２０７０１实施国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会发布书书书前　　言　　本文件按照ＧＢ／Ｔ１．１—２０２０《标准化工作导则　第１部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国水产标准化技术委员会（ＳＡＣ／ＴＣ１５６）归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、北京海关、连云港海关。本文件主要起草人：林祥梅、张、王娜、吴绍强、景宏丽、谷强、任彤、周毅、江育林。Ⅰ犌犅／犜４１１８５—２０２１水生动物病原犇犖犃检测参考物质制备和质量控制规范　质粒１　范围本文件给出了作为水生动物病原ＤＮＡ检测阳性参考物质的质粒，其质量控制规范术语和定义、缩略语、原理、试剂或材料、仪器设备，规定了质粒制备的通用要求、质粒的质量控制、质粒的验证，以及质粒的质量评价方法。本文件适用于水生动物病原ＤＮＡ核酸检测中质粒的制备和质量控制。２　规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法ＳＣ／Ｔ７０１９　水生动物病原微生物实验室保存规范３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１变异系数　犮狅犲犳犳犻犮犻犲狀狋狅犳狏犪狉犻犪狋犻狅狀概率分布离散程度的一个归一化量度，其定义为数据标准差与数据平均值之比。３．２初始样　犳狉狅狀狋狊犪犿狆犾犲按照制备先后顺序，最先制备的１／３批次产品。３．３均匀性　狌狀犻犳狅狉犿犻狋狔同一生产批次的质粒，每支含有等量目的基因的状态。３．４溯源性　狋狉犪犮犲犪犫犻犾犻狋狔质粒中目的基因序列与病原参考毒株序列的一致性。３．５稳定性　狊狋犪犫犻犾犻狋狔质粒在特定保存条件和保存时间范围内，保证检测结果为阳性的能力。３．６阳性参考物质　狆狅狊犻狋犻狏犲狉犲犳犲狉犲狀犮犲犿犪狋犲狉犻犪犾与病原拥有某些完全相同的特征，如相同的目的基因序列、抗原性、敏感性等，用于该病原检测一定会得出理想的阳性检测结果，通常作为阳性对照判定待测样品是否为病原阳性。１犌犅／犜４１１８５—２０２１３．７中间样　犿犻犱犱犾犲狊犪犿狆犾犲按照制备先后顺序，中间制备的１／３批次产品。３．８终止样　犳犻狀犪犾狊犪犿狆犾犲按照制备先后顺序，最后制备的１／３批次产品。３．９最小有效取样量　犿犻狀犻犿狌犿犲犳犳犲犮狋犻狏犲狊犪犿狆犾犲狏狅犾狌犿犲使用病原检测方法，可检测出阳性结果的最小阳性参考物质的量。４　缩略语下列缩略语适用于本文件。Ａｍｐ：氨苄青霉素（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）Ｃｔ：扩增循环数（ｃｙｃｌｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）ＤＮＡ：脱氧核糖核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）ｄＡＴＰ：三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ｄＣＴＰ：三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ｄＧＴＰ：三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ｄＮＴＰ：脱氧核糖核苷三磷酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ｄＴＴＰ：三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ＥＢ：溴化乙锭（ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）ＩＰＴＧ：异丙基βＤ硫代半乳糖苷（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｂｅｔａＤｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）ＬＢ：营养肉汤（ｌｕｒｉａｂｅｒｔａｎｉｂｒｏｔｈ）ＰＣＲ：聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）ｑＰＣＲ：实时荧光定量聚合酶链式反应（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）犜犪狇：水生嗜热菌（犜犺犲狉犿狌狊犪狇狌犪狋犻犮狌狊）５　原理利用基因重组技术，将目的ＤＮＡ片段连接入空质粒中，再将连接产物转化入感受态细胞，筛选出含有阳性重组质粒的细胞，再从细胞中提取质粒，制备流程按照附录Ａ进行。为满足病原分子生物学检测要求，作为ＤＮＡ参考物质的质粒应具备以下特征：包含有针对检测病原的目的ＤＮＡ片段；不易降解，不会丢失病原ＤＮＡ片段；易于大量制备提纯；可用于病原定性或定量检测。６　试剂或材料６．１　水：符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水规定。６．２　ＰＣＲ试剂和ｑＰＣＲ试剂：商品化试剂。６．３　扩增病原目的基因的引物：可参照相应的国家标准或行业标准合成。６．４　琼脂糖：电泳纯。２犌犅／犜４１１８５—２０２１６．５　空质粒：商品化试剂。６．６　经高温高压灭菌处理的水、缓冲液、离心管、试管、ＰＣＲ管、移液器枪头、培养皿、三角瓶、涂布棒或棉签。６．７　制备质粒所需的其他试剂：按照附录Ｂ配制。７　仪器设备７．１　超净工作台。７．２　高速冷冻离心机。７．３　电子天平。７．４　高压灭菌锅。７．５　ＰＣＲ仪。７．６　荧光定量ＰＣＲ仪。７．７　电泳仪。７．８　紫外分光光度计。７．９　凝胶成像系统。７．１０　移液器。８　质粒制备的通用要求８．１　目的犇犖犃的选择目的ＤＮＡ片段应含有该病原检测方法中推荐的全部目的基因序列。８．２　空质粒的选择空质粒应具备以下特征：ａ）　多克隆位点可以容纳全部目的基因片段；ｂ）　性质稳定，不易产生基因变异；ｃ）　具备抗生素抗性基因或犾犪犮犣基因，转化入感受态细胞后可进行抗性筛选或蓝白筛选。８．３　连接反应连接反应前，目的ＤＮＡ片段和空质粒应提纯。８．４　连接产物转化入感受态细胞每批转化实验，应设置未处理的感受态细胞作为空白对照、转化空质粒的感受态细胞作为阴性对照，转化已知重组质粒的感受态细胞作为阳性对照。只有在空白对照、阴性对照和阳性对照都成立的情况下，才能判定连接产物是否转化入感受态细胞。８．５　质粒的纯度检测使用紫外分光光度计测量质粒的犃２６０／犃２８０比值。若比值介于１．８～２．０之间，则纯度合格；否则需重新提取。３犌犅／犜４１１８５—２０２１９　质粒的质量控制９．１　质粒的定性检测９．１．１　犘犆犚检测以质粒溶液为模板，同时设立阴性对照（水）和阳性对照（病原ＤＮＡ），进行ＰＣＲ检测，电泳观察检测结果，或使用质粒上的通用引物做ＰＣＲ检测。９．１．２　目的基因的溯源性分析对质粒多克隆位点进行测序，测序结果与相应病原参考株的序列进行比对。９．１．３　结果判定在阴性对照和阳性对照都成立的情况下：ａ）　可检测到目的ＤＮＡ，且测序结果与相应病原参考株的序列同源性至少达到９９％，则质粒可作为阳性参考物质用于病原的定性分子生物学检测；ｂ）　无明显的目的ＤＮＡ，或测序结果与相应病原参考株的序列同源性低于９９％，则说明病原目的ＤＮＡ并未正确插入质粒，或质粒提纯失败，需重新制备提纯。９．２　质粒的定量检测９．２．１　狇犘犆犚方法以目的ＤＮＡ中的保守序列为模板，设计引物和探针。分别以质粒和空质粒为模板进行ｑＰＣＲ，对所设计的引物探针进行特异性检测。ａ）　质粒检测结果为阳性，空质粒为阴性，则该套引物探针可以特异性扩增目的ＤＮＡ，可用于目的ＤＮＡ的定量检测；ｂ）　检测结果都为阳性，则该套引物探针也可以与空质粒某段基因反应，不能用于目的ＤＮＡ的定量检测，应重新设计引物探针；ｃ）　检测结果都为阴性，则该套引物探针不能与目的ＤＮＡ反应，应重新设计引物探针，或优化反应体系和反应条件。９．２．２　标准品的选择和定量将纯化的目的ＤＮＡ作为标准品，用于ｑＰＣＲ标准曲线的制备。使用分光光度计测量目的ＤＮＡ的质量分数，再根据公式（１）换算成拷贝数浓度：（６．０２×１０２０）×犖／犕犠＝犢…………………………（１）　　式中：犖———目的ＤＮＡ的质量分数，单位为克每毫升（ｇ／ｍＬ）；犕犠———分子量的数值，单位为克每摩尔（ｇ／ｍｏｌ）；犢———目的ＤＮＡ溶液拷贝数浓度的数值，单位为拷贝数每微升（ｃｏｐｉｅｓ／μＬ）。目的ＤＮＡ拷贝数浓度不应低于１０１０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ拷贝数，若低于此浓度，应加大ＤＮＡ提取量，再提纯。４犌犅／犜４１１８５—２０２１９．２．３　制备标准曲线９．２．３．１　将标准品（目的ＤＮＡ溶液）１０倍梯度稀释５次。９．２．３．２　使用９．２．１设计的引物探针，以标准品原液及５次梯度稀释溶液为模板，进行ｑＰＣＲ扩增。９．２．３．３　以标准品Ｃｔ值和对应的拷贝数，制备标准曲线，曲线横坐标为反应体系中加入样品的拷贝数，纵坐标为Ｃｔ值；标准曲线犚值不低于０．９８。若各稀释度标准品的Ｃｔ值无法形成良好的线性关系，需重新梯度稀释标准品，制备标准曲线。９．２．４　质粒中病原犇犖犃的定量９．２．４．１　使用９．２．１设计的引物探针，以提纯的质粒为模板，设置３个平行对照，测定质粒的Ｃｔ值。９．２．４．２　以水为模板设置阴性对照，以病原ＤＮＡ为模板设置阳性对照。９．２．４．３　在阴性对照和阳性对照都成立的情况下，根据标准曲线，３个平行对照样品Ｃｔ值分别对应３个拷贝数，将拷贝数平均值除以反应体系中加入的样品体积，即为质粒真实的拷贝数浓度。若质粒的Ｃｔ值小于标准品原液的Ｃｔ值，需将质粒稀释１０倍或１００倍后，重新进行定量。９．３　最小有效取样量的测定在已知浓度的基础上，分别取０．５μＬ、１μＬ、２μＬ、５μＬ和１０μＬ质粒溶液作为模板，按照相应病原检测方法推荐的方法进行核酸扩增，观察检测结果。获得阳性结果的最低模板量为最小有效取样量。９．４　质粒均匀性检测９．４．１　检测方法９．４．１．１　以初始样、中间样、终止样三阶段分别随机抽取共１０份质粒样品。９．４．１．２　分别以１０份质粒为模板，使用相应病原检测方法推荐的引物和实验条件进行ＰＣＲ或ｑＰＣＲ扩增。９．４．１．３　ＰＣＲ产物电泳，或ｑＰＣＲ产物读数并计算变异系数。９．４．２　质粒均匀性判定均匀性判定方法如下：ａ）　１０份质粒样品的检测结果全部为阳性，ＰＣＲ扩增的１０条ＤＮＡ条带亮度相近，或ｑＰＣＲ得出的１０份样品Ｃｔ值变异系数≤１０％，表明样品均匀性良好；ｂ）　有样品为弱阳性，甚至为阴性；或ｑＰＣＲ的１０份样品Ｃｔ值变异系数＞１０％，则表明样品均匀性不良，需重新混匀分装。９．５　质粒稳定性检测设置３组质粒样品，分别放置于３７℃、４℃、－２０℃保存。分别在第１天、第３天、第５天、第７天、第２周、第３周、第１月直至第１年时间段，每组各取３支样品，１个样品应至少设３个重复，使用相应病原检测方法推荐的引物和实验条件进行检测。若质粒经以下３种方法平行处理后，ＰＣＲ或ｑＰＣＲ检测结果仍为阳性，说明稳定性良好，否则需重新制备：ａ）　３７℃至少保存７ｄ；５犌犅／犜４１１８５—２０２１ｂ）　４℃至少保存３周；ｃ）　－２０℃以下至少保存１年。９．６　质粒的保存９．６．１　质粒溶液的保存质粒原液分装成５０μＬ／管，低于－２０℃条件下保存不超过１年，避免反复冻融，４℃条件下保存不超过３周。使用时取出相应的量，根据９．２规定的方法重新检测合格后使用。９．６．２　携带质粒菌株的保存符合ＳＣ／Ｔ７０１９的规定。１０　质粒参考物质的验证质粒作为水生动物病原ＤＮＡ检测参考物质，应经过至少５家具备核酸提取和分子生物学检测能力的水生动物检测实验室的协作定值，定值内容包括病原目的ＤＮＡ片段的特异性、定性检测、定量检测等内容，定性检测要求检测结果为阳性，定量检测要求Ｃｔ值误差范围不超过±３．３。定值结果都合格后，才能投入使用。１１　质粒参考物质的质量判定经９．１～９．６步骤检测，质粒应同时满足以下５项要求，才能作为水生动