GBT 38580-2020 微生物诱变育种技术规范

书书书犐犆犛０７．０８０犃２１!#$%&’’()*犌犅／犜３８５８０—２０２０!#$%&’()*+犜犲犮犺狀犻犮犪犾狊狆犲犮犻犳犻犮犪狋犻狅狀犳狅狉犿狌狋犪犵犲狀犲狊犻狊犫狉犲犲犱犻狀犵狅犳犿犻犮狉狅狅狉犵犪狀犻狊犿狊２０２００３３１,-２０２００３３１./’(+,-./012’()*3/0456,-书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由中国标准化研究院提出并归口。本标准起草单位：清华大学、洛阳华清天木生物科技有限公司、中国标准化研究院。本标准主要起草人：张罛、邢新会、李梅、剪兴金、王立言、郭肖杰、张乐乐、马爱进。Ⅰ犌犅／犜３８５８０—２０２０微生物诱变育种技术规范１　范围本标准规定了微生物诱变育种要求和证实方法。本标准适用于细菌、放线菌、酵母和霉菌等微生物的紫外、等离子体和化学诱变育种。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１５１９３．１９　食品安全国家标准　致突变物、致畸物和致癌物的处理方法３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１菌种　狊狋狉犪犻狀狊面向工业、农业、食品、医药等用途，在发酵过程中发挥生理代谢作用的微生物。３．２诱变　犿狌狋犪犵犲狀犲狊犻狊通过人为的措施诱导遗传物质产生突变的方法。３．３微生物诱变育种　犿狌狋犪犵犲狀犲狊犻狊犫狉犲犲犱犻狀犵狅犳犿犻犮狉狅狅狉犵犪狀犻狊犿狊以人工诱变手段诱发微生物遗传物质发生突变，并从突变群体中筛选出所需要的突变株，进而培育成新品种的育种方法。４　要求４．１　人员试验人员应熟悉基本微生物操作，在开展相关试验前应充分了解使用微生物、诱变剂存在的风险和安全操作规范，试验过程中做好相应防护。４．２　设施与环境具有能开展基本微生物试验的实验室或车间，配备相关水、电、气等基础设施；实验室生物安全等级需满足所诱变微生物的要求。４．３　诱变材料４．３．１　总则诱变材料应遵循以下原则：１犌犅／犜３８５８０—２０２０ａ）　单个、分散的细胞，宜呈悬浮状态；ｂ）　细胞核越少越好，最好是单核；ｃ）　按照菌种类型选择合适的培养条件，保证菌种具有旺盛的活力；ｄ）　诱变材料制作过程应在超净工作台中进行，所加试剂和溶液应提前进行灭菌或过滤除菌操作。４．３．２　菌悬液将菌种接种至合适的培养基中，培养至对数生长期，离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤两次，再用适量生理盐水重悬使菌体浓度调整到１×１０６ＣＦＵ／ｍＬ～１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ。４．３．３　孢子悬浮液将菌种接种至固体平板或斜面上培养至产生大量孢子；用生理盐水洗脱并离心收集。用生理盐水洗涤两次，再用适量生理盐水重悬并通过机械振荡使其充分分散；过滤除掉菌丝体。最后用生理盐水悬浮得到均匀的孢子悬浮液，并将其浓度调整到１×１０６ＣＦＵ／ｍＬ～１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ。４．３．４　菌丝悬浮液将菌种接种到合适的培养基中培养至产生大量生长旺盛的菌丝，取一定量菌液并离心收集。用生理盐水洗涤两次，再用适量生理盐水重悬并通过机械振荡使菌丝断裂，过滤除去未断裂的菌丝。最后用生理盐水悬浮得到均匀的菌丝悬浮液，并将其浓度调整到１×１０６ＣＦＵ／ｍＬ～１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ。４．３．５　原生质体悬浮液将菌种接种到合适的培养基上，培养获得大量新鲜菌丝或孢子，收集菌丝或孢子。用渗透压稳定剂洗涤两次并重悬，向重悬液中加入一定量破壁酶，在最适条件下酶解，定时取样于显微镜下观察原生质体释放情况。酶解完成后过滤除去未酶解的菌丝，离心收集原生质体，用渗透压稳定剂洗涤原生质体三次，并将其浓度调整到１×１０６ＣＦＵ／ｍＬ～１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ。４．４　诱变育种操作４．４．１　紫外诱变紫外诱变育种操作要求如下：ａ）　参数设定：宜选择如下参数，紫外线波长２６０ｎｍ，紫外灯功率１０Ｗ～３０Ｗ，照射距离１０ｃｍ～３０ｃｍ。细菌、原生质体、链霉菌孢子悬浮液照射时间宜选择１０ｓ～９０ｓ，酵母、霉菌孢子悬浮液照射时间宜选择１ｍｉｎ～１０ｍｉｎ。对于不同的微生物样品和诱变要求应优化选择合适的参数。ｂ）　提前２０ｍｉｎ～３０ｍｉｎ开紫外灯。ｃ）　诱变材料应置于带无菌搅拌子的玻璃平皿中，边照射边搅拌。ｄ）　每个样品需设三个重复，取相同的诱变材料作为阴性对照，不照射紫外光。ｅ）　诱变后所有步骤应在暗室红光灯下操作。ｆ）　处理完成后的材料和阴性对照应避光冰浴１ｈ～２ｈ。ｇ）　诱变后样品材料和阴性对照应进行梯度稀释，吸取合适稀释度的菌液涂布固体平板，避光培养至产生单菌落。ｈ）　应统计诱变和阴性对照平板菌落数，计算诱变致死率。４．４．２　常压室温等离子体诱变常压室温等离子体诱变育种操作要求如下：２犌犅／犜３８５８０—２０２０ａ）　参数设定：宜选择如下参数，照射功率１００Ｗ～１２０Ｗ，照射距离２ｍｍ，工作气体流量１０Ｌ／ｍｉｎ。细菌、原生质体、链霉菌孢子悬浮液照射时间宜选择３０ｓ～５ｍｉｎ，酵母、霉菌孢子悬浮液照射时间宜选择１ｍｉｎ～６ｍｉｎ。ｂ）　每个样品应设三个重复，取相同的诱变材料作为阴性对照，阴性对照不照射等离子体。ｃ）　照射结束后，应立即把照射过样品放入准备好的预先加入培养基的无菌离心管中，混合均匀。ｄ）　处理完成后的材料和阴性对照应做梯度稀释，选择稀释度合适的菌液涂布固体平板，培养至产生单菌落。ｅ）　应统计诱变和阴性对照平板菌落数，计算诱变致死率。４．４．３　化学诱变化学诱变要求如下：ａ）　化学诱变剂的选择：宜根据诱变材料和诱变要求选择合适的化学诱变剂，常用的化学诱变剂及其配制方法参见附录Ａ和附录Ｂ。ｂ）　化学诱变剂浓度：不同微生物常用诱变剂浓度及处理时间参见附录Ｃ。ｃ）　在诱变材料中分别加入不同浓度梯度的诱变剂工作液，混匀后处理不同时间。如需要应再加入反应终止液终止反应，离心，弃掉上清，用无菌去离子水洗涤诱变处理过的菌体。ｄ）　每个诱变剂量组或每个处理时间组应设三个重复，阴性对照组不加入化学诱变剂，以加入等量无菌水代替。ｅ）　处理完成后的材料和阴性对照应做梯度稀释，选择稀释度合适的菌液涂布固体平板，培养至产生单菌落。ｆ）　应统计诱变和阴性对照平板菌落数，计算诱变致死率。ｇ）化学诱变剂使用后应按ＧＢ１５１９３．１９的方法进行处理。５　证实方法诱变结果以致死率表示，致死率按式（１）计算：ＬＲ＝犆Ｃ－犆Ｔ犆Ｔ×１００％…………………………（１）　　式中：ＬＲ———致死率；犆Ｃ———阴性对照平板菌落数；犆Ｔ———试验组平板菌落数。３犌犅／犜３８５８０—２０２０附　录　犃（资料性附录）化学诱变剂种类、作用机制及常用化学诱变剂　　化学诱变剂的种类、作用机制及常用化学诱变剂见表Ａ．１。表犃．１化学诱变剂种类作用机制常用诱变剂碱基类似物代替ＤＮＡ中的正常碱基５溴尿嘧啶（５ＢＵ）５氟尿嘧啶（５ＦＵ）６氮杂尿嘧啶（６ＮＵ）２氨基嘌呤（２ＡＰ）６巯基嘌呤（６ＭＰ）８氮鸟嘌呤（８ＮＧ）烷化剂对ＤＮＡ分子中碱基的烷基化修饰亚硝基乙基脲亚硝基胍硫酸二乙酯硫酸（磺酸）酯类甲基磺酸甲酯甲基磺酸乙酯移码诱变剂移码突变吖啶橙原黄素氧化类诱变剂ＤＮＡ碱基氧化损伤亚硝酸（及其盐）金属离子机制尚不清楚锰离子４犌犅／犜３８５８０—２０２０附　录　犅（资料性附录）常用化学诱变剂配制方法犅．１　亚硝基胍（犖犜犌）配制方法如下：———ｐＨ６．０磷酸缓冲液：分别配制０．２ｍｏｌ／Ｌ的Ｎａ２ＨＰＯ４·２Ｈ２Ｏ溶液、０．２ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＨ２ＰＯ４·２Ｈ２Ｏ溶液，前者取出１２．３ｍＬ，后者取出８７．７ｍＬ，两者混合即得ｐＨ６．０的磷酸缓冲液。———１ｍｇ／ｍＬ亚硝基胍溶液：称取５０ｍｇ亚硝基胍，用５ｍＬ丙酮溶解，４℃保存。用之前向其中加入４５ｍＬｐＨ６．０磷酸缓冲液，振荡使其充分溶解，过滤除菌。———诱变终止剂：０．０７ｍｏｌ／ＬｐＨ８．６磷酸氢二钠缓冲液。取磷酸二氢钠２．５０７ｇ，溶于１００ｍＬ无菌水中，过滤除菌。犅．２　亚硝酸钠（犖犐犜）配制方法如下：———ｐＨ４．５醋酸缓冲液：称取醋酸钠１８ｇ，冰醋酸９．８ｍＬ于１Ｌ烧杯中，加入少量蒸馏水溶解，移入１０００ｍＬ容量瓶中定溶，充分混匀过滤除菌，４℃保存备用。———０．１ｍｏｌ／Ｌ亚硝酸钠溶液：取亚销酸钠０．６９ｇ，溶于１００ｍＬ无菌水中，过滤除菌。使用时与ｐＨ４．５的醋酸缓冲液以１∶２的体积比混合后使用。———诱变终止剂：２５％的Ｎａ２Ｓ２Ｏ３溶液。称取４ｇＮａ２Ｓ２Ｏ３·５Ｈ２Ｏ，溶解于６ｍＬ蒸馏水中。放置在４℃冰箱中备用，使用时过滤灭菌。与诱变液的体积比为１∶１。犅．３　硫酸二乙酯（犇犈犛）配制方法如下：———硫酸二乙酯不溶于水，溶于乙醇或乙醚半衰期短，在３０℃条件下半衰期为１ｈ，所以需要现用现配。取０．５ｍＬＤＥＳ溶解于４．５ｍＬ无水乙醇中，配制成１０％的储备液，过滤除菌。犅．４　甲基磺酸乙酯（犈犕犛）配制方法如下：———ｐＨ７．０的磷酸缓冲液：称取Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ９．３９ｇ与ＫＨ２ＰＯ４３．５ｇ，加蒸馏水定容至１０００ｍＬ，过滤，１２１℃灭菌１５ｍｉｎ或１１５℃灭菌３０ｍｉｎ；———准确称取５．４０８ｇＥＭＳ粉末于１０ｍＬ容量瓶中，先加入６ｍＬｐＨ７．０的磷酸缓冲液溶解，后定容至１０ｍＬ，配成５．０ｍｏｌ／Ｌ的母液，４℃保藏，临用前过滤除菌。５犌犅／犜３８５８０—２０２０附　录　犆（资料性附录）常用化学诱变剂诱变条件及致死率　　常用化学诱变剂诱变条件及致死率见表Ｃ．１。表犆．１诱变剂工作浓度诱变菌种诱变时间致死率诱变温度亚硝酸钠（ＮＩＴ）０．０５ｍｏｌ／Ｌ产小檗碱内生真菌菌丝悬液３０ｍｉｎ７６．６％２７℃０．０２５ｍｏｌ／Ｌ绿色木霉孢子悬液１０ｍｉｎ７５．４％室温２ｍｇ／ｍＬ茂源链霉菌孢子悬液３０ｍｉｎ９９．９％３０℃０．０２５ｍｏｌ／Ｌ粘帚霉菌孢子悬液４ｍｉｎ８９．８％０．０２５ｍｏｌ／Ｌ白腐真菌孢子悬液１０ｍｉｎ～２０ｍｉｎ８５％～９５％２５℃～２６℃０．０５ｍｏｌ／Ｌ平贝母内生真菌菌丝悬液２０ｍｉｎ８５．７％室温０．０２５ｍｏｌ／Ｌ蜡状芽孢杆菌菌悬液２５ｍｉｎ７８．５６％２６℃亚硝基胍（ＮＴＧ）２ｍｇ／ｍＬ茂源链霉菌孢子悬液２０ｍｉｎ９９．７％３０℃０．５ｍｇ／ｍＬ蜡状芽孢杆菌菌悬液４０ｍｉｎ２５．９３％２８℃０．４ｍｇ／ｍＬ枯草芽孢杆菌菌悬液３０ｍｉｎ７３．４７％３０℃１ｍｇ／ｍＬ植物乳杆菌菌悬液４０ｍｉｎ７６．５４％３０℃１ｍｇ／ｍＬ放线菌孢子悬液４５ｍｉｎ８５．３６％硫酸二乙酯（ＤＥＳ）１％粗壮脉纹孢菌孢子悬液６０ｍｉｎ＞９９％３０℃１％绿色木霉孢子悬液４０ｍｉｎ８０．２％３０℃０．０２％山东链霉菌菌悬液６０ｍｉｎ１００％２８℃６犌犅／犜３８５８０—２０２０表犆．１（续）诱变剂工作浓度诱变菌种诱变时间致死率诱变温度硫酸二乙酯（ＤＥＳ）０．５％嗜热厌氧菌菌悬液２０ｍｉｎ６５％４２℃１％蜡状芽孢杆菌菌悬液６０ｍｉｎ９３．１％３０℃１％放线菌孢子悬液４５ｍｉｎ９６．１３％２８℃甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ）０．４ｍｏｌ／Ｌ酿酒酵母６０ｍｉｎ７０％～８０％２０℃氯化锂１．２％乳酸杆菌菌液３ｄ８３．２％３７℃０．２％放线菌孢子悬液３ｄ３６．５７％２８℃犌犅／犜３８５８０—２０２０