SNT 5479-2022 非洲猪瘟实验室快速检测方法

ICS65.020.30B41中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5479—2022非洲猪瘟实验室快速检测方法LaboratoryrapiddetectionmethodsforAfricanswinefever2022-07-07发布2023-02-01实施中华人民共和国海关总署发布学兔兔标准下载目次前言Ⅲ…………………………………………………………………………………………………………1范围1………………………………………………………………………………………………………2规范性引用文件1…………………………………………………………………………………………3术语和定义1………………………………………………………………………………………………4缩略语1……………………………………………………………………………………………………5实验室生物安全基本要求1………………………………………………………………………………6双抗体夹心酶联免疫吸附试验2…………………………………………………………………………6.1技术原理2……………………………………………………………………………………………6.2试剂与设备2…………………………………………………………………………………………6.3检测步骤2……………………………………………………………………………………………7抗原检测胶体金免疫层析法3……………………………………………………………………………7.1技术原理3……………………………………………………………………………………………7.2试剂与材料3…………………………………………………………………………………………7.3检测步骤4……………………………………………………………………………………………8非洲猪瘟阻断酶联免疫吸附试验4………………………………………………………………………8.1技术原理4……………………………………………………………………………………………8.2试剂与设备5…………………………………………………………………………………………8.3检测步骤5……………………………………………………………………………………………9非洲猪瘟间接酶联免疫吸附试验6………………………………………………………………………9.1技术原理6……………………………………………………………………………………………9.2试剂与设备6…………………………………………………………………………………………9.3检测步骤6……………………………………………………………………………………………10抗体检测胶体金免疫层析法7……………………………………………………………………………10.1技术原理7……………………………………………………………………………………………10.2试剂与材料7…………………………………………………………………………………………10.3检测步骤8……………………………………………………………………………………………11重组酶聚合酶扩增试验8…………………………………………………………………………………11.1技术原理8……………………………………………………………………………………………11.2试剂与材料8…………………………………………………………………………………………11.3设备与材料9…………………………………………………………………………………………11.4检测步骤9……………………………………………………………………………………………附录A(规范性)ELISA用试剂的配制11………………………………………………………………ⅠSN/T5479—2022学兔兔—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国深圳海关、湖南普简生物科技有限公司、深圳市检验检疫科学研究院、深圳技术大学、中华人民共和国上海海关。本文件主要起草人:林彦星、花群义、吴江、黄超华、杨俊兴、史卫军、曹琛福、张强、曾少灵、金业、贾鹏、李健、林永涛、阮周曦。ⅢSN/T5479—2022学兔兔范围本文件规定了非洲猪瘟双抗体夹心酶联免疫吸附试验、抗原检测胶体金免疫层析法、阻断酶联免疫吸附试验、间接酶联免疫吸附试验、抗体检测胶体金免疫层析法和重组酶聚合酶扩增试验的技术要求。本文件适用于出入境检疫中非洲猪瘟流行病学调查、疫情监测和实验室快速检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T5335非洲猪瘟检测实验室生物安全操作技术规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。ASFV:Africanswinefevervirus,非洲猪瘟病毒;CTAB:cetyltrithylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵;DNA:deoxyribonuleicacid,脱氧核糖核酸;EDTA:ethylenediaminetetraaceticacid,乙二胺四乙酸;ELISA:enzyme-linkedimmunosorbentassay,酶联免疫吸附试验;HRP:horseradishperoxidase,辣根过氧化物酶;McAb:Monoclonalantibody,单克隆抗体;OD值:opticaldensity,光密度值;PBS:phosphatebufferbaline,磷酸盐缓冲溶液;PI值:percentageinhibition,阻断百分率;RPA:recombinasepolymeraseamplification,重组酶聚合酶扩增;Tris:tris(hydroxymethyl)aminomethane,三(羟甲基)氨基甲烷;T值:Timethreshold,阈值时间。5实验室生物安全基本要求进行非洲猪瘟实验室快速检测时,应按照GB19489执行,并符合SN/T5335中的规定。1SN/T5479—2022学兔兔形成固相抗体。然后加入待检样品,如样品中含有特异性抗原,则与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物,通过洗涤去除其他未结合物质,加入HRP标记的另一个ASFVVP72McAb,形成一抗+抗原+酶标二抗固相免疫复合物,加入底物后出现显色反应,来判定待检样品中的抗原含量。6.2试剂与设备6.2.1ASFVVP72McAb:由指定单位提供。6.2.2HRP标记的ASFVVP72McAb(针对VP72蛋白的不同表位):由指定单位提供。6.2.3ASFV阳性对照抗原、阴性对照抗原:由指定单位提供。6.2.4包被液、洗涤液、封闭液、稀释液、底物液及终止液:见附录A。6.2.5离心机、酶标仪、洗板机。6.2.6可拆96孔酶标板、一次性加样槽、单头微量可调移液器(10μL,100μL,1000μL)、8排微量可调移液器(30μL~300μL)及配套吸头。6.3检测步骤6.3.1ASFVVP72McAb包被用包被液将ASFVVP72McAb稀释至指定工作浓度,加入到酶标板中,每孔100μL,4℃冰箱过夜。6.3.2洗涤取出酶标板甩去液体,并在洁净的吸水纸上轻拍干,每孔加入300μL洗涤液,甩去孔内洗涤液,在洁净的吸水纸上轻拍干,如此重复洗3次;也可用洗板机进行洗涤。6.3.3封闭每孔加封闭液200μL,37℃作用2h;按照6.3.2所述方法进行洗涤。6.3.4待检样品处理6.3.4.1血清样品:取新鲜血液放于离心管中,静置,待血液凝固后,3000r/min离心5min,所得上清液即为血清,小心吸出上清液备用。6.3.4.2血浆样品:取新鲜血液加入到含抗凝剂的离心管中,颠倒混匀,3000r/min离心5min,所得的上清即为血浆,小心吸出上清液备用。6.3.4.3组织:取组织块约1g,放入1.5mL离心管中,加入200μL稀释液,用研磨棒研磨,使用离心机3000r/min离心5min,取上清。6.3.4.4咽喉部拭子:将拭子放入1.5mL离心管中,加入200μL稀释液,充分混匀,使用离心机3000r/min离心5min,取上清。6.3.5加样将处理好的待检样品和阴性对照抗原、阳性对照抗原分别加入酶标板,每份样品做两孔,每孔2SN/T5479—2022学兔兔轻轻混匀酶标板后置于37℃湿盒孵育1h;用洗涤液洗酶标板孔6次。6.3.6加HRP标记的ASFVVP72McAb用稀释液将HRP标记VP72McAb稀释至指定工作浓度,加入到酶标板中,每孔100μL,轻轻混匀,37℃湿盒孵育45min;用洗涤液洗酶标板孔6次。6.3.7显色每孔加入底物液100μL,轻轻混匀,室温避光显色10min~15min。6.3.8终止每孔加入100μL终止液。6.3.9结果读取加终止液后在5min之内,采用酶标仪在450nm波长下测定OD值。6.3.10结果判定6.3.10.1S/P值的计算待检样品的S/P值按式(1)计算。S/P值=样品平均OD值-阴性对照平均OD值阳性对照平均OD值-阴性对照平均OD值……………………(1)6.3.10.2判定阳性对照平均OD值≥2×阴性对照平均OD值,则试验成立,可进行结果判定。待检样品S/P值≥0.25时判为抗原阳性;待检样品S/P值0.25时判为抗原阴性。也可选用其他商品化试剂盒并按照使用说明书进行操作和结果判定。7抗原检测胶体金免疫层析法7.1技术原理非洲猪瘟抗原胶体金免疫层析试纸卡由样品垫,硝酸纤维素膜(NC膜)和吸水垫3个部分组成。样品垫上喷涂胶体金标记的ASFV一抗,NC膜上喷涂ASFV二抗和兔抗鼠IgG分别作为检测线(T线)和控制线(C线)。检测时待检血液滴加到试纸卡样品垫上,如果待检血液中含有ASFV抗原,则该抗原会与样品垫中的金标特异性单抗结合,结合的复合物沿层析膜移动,被T线上的ASFV抗体捕获并显色,形成一条酒红色的检测线,如果待检血液中不含非洲猪瘟抗原,则T线不显色。同时金标抗体又继续往前到C线与兔抗鼠IgG结合显色。7.2试剂与材料7.2.1样品缓冲液:0.01mol/LpH7.2PBS。7.2.2微量加样器或滴管。7.2.3非洲猪瘟抗原胶体金免疫层析试纸卡,4℃~8℃冷藏保存。使用前将试纸卡放置室温下恢复至室温。3SN/T5479—2022学兔兔全血样品:用无菌方式采集抗凝猪全血,4℃密封冷藏保存,不超过72h。7.3.1.2血清样品:取新鲜血液放于离心管中,静置,待血液凝固后,3000r/min离心5min,所得上清液即为血清,小心吸出上清液备用。7.3.1.3组织:取组织块约1g,放入1.5mL离心管中,加入200μL稀释液,用研磨棒研磨,使用离心机3000r/min离心5min,取上清液备用。7.3.2检测方法检测全血样品时,吸取30μL抗凝全血滴加到试纸卡样品垫,再在样品垫上继续滴入3~4滴缓冲液;检测血清和组织样品时,吸取血清或组织上清液100μL滴入样品垫上;15min~30min内进行结果判定。超过30mi