农业农村部公告第327号 酮洛芬每日允许摄入量和最高残留限量标准(试行)及残留检测方法标准(试行)

附件5酮洛芬每日允许摄入量和最高残留限量标准（试行）及酮洛芬残留检测方法标准（试行）酮洛芬每日允许摄入量和最高残留限量标准（试行）申报单位参照日本有关标准制定了酮洛芬的每日允许摄入量（ADI），参照日本肯定列表中酮洛芬残留限量标准制定了酮洛芬在牛组织中的最高残留限量（MRLs），如下表：活性成分ADI残留标志物动物品种靶组织MRLs（μg/kg）酮洛芬0-1μgkg-1d-1酮洛芬牛牛奶50肌肉50肾脏50肝脏50脂肪50酮洛芬残留检测方法标准（试行）一、牛奶中酮洛芬残留量的测定液相色谱-串联质谱法1范围本标准规定了牛奶中酮洛芬残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于牛奶中酮洛芬残留量的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T1.1-2009标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法3原理试样中酮洛芬残留物用甲醇提取，液相色谱-串联质谱测定，内标法定量。4试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的一级水。4.1酮洛芬对照品（分子式：C16H14O3，含量≥98%）。4.2酮洛芬-D3内标物（分子式：C16H11D3O3，含量≥99.5%）。4.3甲醇：色谱纯。4.4乙腈：色谱纯。4.5甲酸：色谱纯。4.6酮洛芬储备液（1mg/mL）：精密称取酮洛芬对照品50mg置于50mL棕色容量瓶，用30mL甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。分装，置于-20℃冰箱避光保存，有效期1个月。4.7酮洛芬标准工作液：取酮洛芬储备液适量，分别置于10mL棕色容量瓶内，用甲醇稀释至刻度，制得2000ng/mL、1500ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL系列浓度的酮洛芬标准工作液，现配现用。4.8酮洛芬-D3贮备液（1mg/mL）：精密称取含酮洛芬-D3对照品10mg置于10mL棕色容量瓶，用5mL甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。分装，置于-20℃冰箱避光保存，有效期3个月。4.9酮洛芬-D3标准工作液：取酮洛芬-D3储备液适量，置于10mL棕色容量瓶，用甲醇稀释至刻度，制得500ng/mL、250ng/mL的酮洛芬-D3标准工作液，避光，现配现用。4.100.1%甲酸溶液：取1.00mL甲酸加入1L容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得，现配现用。4.110.1%甲酸的乙腈溶液：取1.00mL甲酸加入1L容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得，现配现用。4.120.1%甲酸溶液-0.1%甲酸的乙腈溶液（90/10，v/v）：量取900mL0.1%甲酸溶液与100mL0.1%甲酸的乙腈溶液，混匀即得，现配现用。5仪器和设备5.1液相色谱仪—串联质谱仪：配电喷雾离子源。5.2分析天平：感量0.00001g。5.3天平：感量0.01g。5.4漩涡振荡器。5.5水平振荡器。5.6数控超声波清洗器。5.7高速台式冷冻离心机。5.8数显恒温水浴锅。5.9离心管：50mL。5.10氮吹仪。5.11Millipore-Q超纯水系统。5.12两用型隔膜真空泵。5.13可调微量移液器。5.14滤膜：孔径0.22μm。6试料的制备与保存6.1试料的制备取适量新鲜或冷藏的空白或供试牛奶，混合，并使均质。——取均质的供试样品，作为供试试料。——取均质的空白样品，作为空白试料。——取均质的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。6.2试料的保存-20℃以下保存。7测定步骤7.1样品预处理将牛奶样品解冻至室温，涡旋混匀后准确称取1g试料（精确至0.01g）于50mL具塞聚丙烯离心管中，加入“酮洛芬-D3标准工作液”50μL（浓度为500ng/mL），内标的添加浓度为25ng/mL，涡旋3min，避光静置30min后，加甲醇4mL涡旋1min，200r/min水平振荡10min后，超声10min。于4℃10000r/min离心10min，取上清液转移至10mL离心管中。40℃水浴下氮吹干燥。干燥后，离心管中加入1mL复溶液﹝0.1%甲酸溶液-0.1%甲酸的乙腈溶液（90∶10，v/v）﹞，涡旋，超声10min后，于4℃10000r/min离心10min，取上清液过滤，供液相色谱-串联质谱测定。7.2标准曲线的制备取空白牛奶样品，按“7.1”方法进行处理后得到空白基质，在8支1.5mL离心管中各加入0.8mL空白基质，除第1管外，其余各管依次加入100μL系列浓度的酮洛芬标准工作液和100μL内标标准工作液（浓度为250ng/mL），涡旋混匀，使牛奶中酮洛芬添加浓度依次为5、10、25、50、100、150、200ng/mL，内标添加浓度为25ng/mL。第一管不加酮洛芬作空白对照，具体见表1。按照“7.3”方法上机检测。将牛奶中酮洛芬浓度，以酮洛芬特征离子峰面积与酮洛芬-D3特征离子峰面积之比作为纵坐标，对应的浓度为横坐标，绘制标准曲线。求线性回归方程和相关系数。表1牛奶中酮洛芬标准曲线系列浓度表编号01234567空白牛奶提取液量（μL）1000800800800800800800800内标的添加体积（μL）0100100100100100100100内标工作液浓度（ng/mL）0250250250250250250250酮洛芬工作液的浓度（ng/mL）050100250500100015002000酮洛芬工作液添加体积（μL）0100100100100100100100酮洛芬添加浓度（μg/kg）05102550100150200内标的上机浓度（μg/kg）025252525252525酮洛芬上机浓度（μg/kg）051025501001502007.3测定7.3.1色谱条件色谱柱：AgilentpursuitXRS5-C18，2.0mm×150mm，5μm，或效能相当的色谱柱；柱温：25℃；流动相：A-0.1%甲酸溶液，B-乙腈，梯度条件见表2；流速：0.25mL/min；运行时间：13min；进样量：5μL。表2流动相洗脱梯度时间（分钟）A相%B相%09010190101.510907.51090890101390107.3.2质谱条件离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；干燥气温度：350℃；干燥气流速：9L/min；喷雾气压力：30psig；毛细管电压：4000V；DeltaEMV：200V。表3酮洛芬和内标的定性、定量离子对及碰撞能量参考值化合物定量离子对(m/z)定性离子对(m/z)碰撞电压（V）碰撞能量（eV）酮洛芬255.1＞209.2255.1＞209.21209255.1＞105.012021酮洛芬-D3内标物258.1＞212.1258.1＞212.11209258.1＞105.0120257.4定性测定通过样品色谱图的保留时间与对照品的保留时间、色谱峰的特征离子与相应浓度对照品色谱峰的特征离子相对照定性。样品与对照品保留时间的相对偏差不大于2.5%；样品特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液中对应的相对丰度进行比较，若相对丰度偏差不超过表4的规定，则可判断样品中存在相应的被测物。表4定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度50%20%至50%10%至20%≤10%允许的相对偏差±20%±25%±30%±50%7.5定量测定取试样溶液和相应的基质匹配标准工作液，按内标法定量，标准工作液及试样溶液中的酮洛芬的响应值均应在仪器检测的线性范围内。对于方法学验证时的添加回收样品，采用单点校正的方式定量。相关图谱参考附件A。7.6空白试验除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。8结果计算和表述单点校准：由X=（Ai×A´is×Cs×Cis×V×f）/（Ais×As×C´is×m）或基质匹配标准曲线校准：X=（C×V×f）/m式中：X——供试试料中酮洛芬的残留量，μg/kg；C——由基质匹配标准曲线得到的酮洛芬浓度，μg/L；Ai——供试试料溶液中酮洛芬的峰面积；A´is——基质匹配标准溶液中酮洛芬-D3的峰面积；Cs——基质匹配标准溶液中酮洛芬的浓度，μg/L；Cis——供试试料溶液中酮洛芬-D3的浓度，μg/L；Ais——供试试料溶液中酮洛芬-D3的峰面积；As——基质匹配标准溶液中酮洛芬的峰面积；C´is——基质匹配标准溶液中酮洛芬-D3的浓度，μg/L；V——残余物定容体积，mL；m——供试试料质量，g；f——稀释倍数。注:计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留两位有效数字。9检测方法灵敏度、准确度、精密度9.1灵敏度本方法检测限为1.0μg/kg，定量限为10.0μg/kg。9.2准确度本方法在10～100μg/kg添加浓度水平的回收率为80%～110%。9.3精密度本方法的批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤20%。附录A（资料性附录）图A1牛奶空白试样溶液特征离子色谱图图A2牛奶基质匹配酮洛芬标准溶液特征离子色谱图（5μg/L）图A3牛奶空白添加试样溶液特征离子色谱图（10μg/kg）（图A1～A3中由上至下依次为酮洛芬-D3内标物、酮洛芬特征离子质量色谱图258.1105.0、258.1212.1、255.1105.0、255.1209.2）二、牛可食性组织中酮洛芬残留量的测定液相色谱-串联质谱法1范围本标准规定了牛可食性组织中酮洛芬残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于牛肌肉、肾脏、肝脏和脂肪组织中酮洛芬残留量的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T1.1-2009标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法3原理试样中酮洛芬残留物用乙腈-水（80/20）提取，过反相固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。4试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的一级水。4.1酮洛芬对照品（分子式：C16H14O3，含量≥98%）。4.2甲醇：色谱纯。4.3乙腈：色谱纯。4.4甲酸：色谱纯。4.5酮洛芬储备液（1mg/mL）：精密称取酮洛芬对照品50mg置于50mL棕色容量瓶，用30mL甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即成1mg/mL的酮洛芬储备液。分装，置于-20℃冰箱避光保存，有效期1个月。4.6酮洛芬标准工作液：取酮洛芬储备液适量，分别置于10mL棕色容量瓶内，用甲醇稀释至刻度，制得1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、50ng/mL、10ng/mL系列浓度的酮洛芬标准工作液，现用现配。4.7乙腈-水（80/20）：量取乙腈80mL与水20mL混匀，即成乙腈-水（80/20，v/v），现用现配。5仪器和设备5.1高效液相色谱仪—串联质谱仪：配电喷雾离子源。5.2分析天平：感量0.00001g。5.3天平：感量0.01g。5.4涡旋振荡器。5.5超声波清洗器。5.6高速台式冷冻离心机。5.7离心管：50mL。5.8氮吹仪。5.9Millipore-Q超纯水系统。5.10可调微量移液器。5.11滤膜：0.22μm。5.12反相固相萃取柱：如AgilentCaptivaEMR-Lipid，3mL/300mg或效能相当的萃取柱。6试料的制备与保存6.1试料的制备取适量新鲜或解冻的空白或供试牛组织，绞碎并使均质。—