BJS 201702 原料乳及液态乳中舒巴坦的测定

——18—附件2原料乳及液态乳中舒巴坦的测定BJS2017021范围本标准规定了原料乳及液态乳中舒巴坦的高效液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于原料乳及液态乳（酸奶除外）中舒巴坦的测定。2原理原料乳或液态乳用酸性水溶液超声提取，离心后上清液用固相萃取小柱净化，经液相色谱-串联质谱法测定和确证，外标法定量。3试剂和材料注：水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂3.1.1甲醇（CH3OH）：色谱纯。3.1.2乙腈（CH3CN)：色谱纯。3.1.3乙酸（CH3COOH）：分析纯。3.2舒巴坦标准品舒巴坦标准品的分子式、相对分子量、CAS登录号见表1，纯度≥99%。表1舒巴坦标准品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量中文名称英文名称CAS登录号分子式相对分子量舒巴坦Sulbactam68373-14-8C8H11NO5S233.243.3标准溶液配制3.3.1舒巴坦标准储备液：称取舒巴坦标准品（3.2）0.01g（精确至0.0001g），用水溶解并定容至100mL，标准储备液的浓度为0.1mg/mL，贮存于4℃冰箱中，有效期3个月。3.3.2舒巴坦标准工作液：吸取舒巴坦标准储备液（3.3.1）1.00mL于100mL的容量瓶中，用水定容至刻度，配得浓度为1.0μg/mL的标准工作溶液，此溶液现配现用。3.40.2%乙酸水溶液：准确量取2mL乙酸（3.1.3），用水定容至1000mL。3.5HLB固相萃取小柱，200mg/6mL，或相当者。3.6微孔滤膜，0.22µm，有机相。4仪器和设备4.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。4.2超声波清洗器。4.3涡旋混合仪。4.4分析天平：感量分别为0.01g和0.0001g。4.5氮吹仪。4.6离心机：转速≥8000r/min。—19——5分析步骤5.1试样制备5.1.1提取称取试样5g（精确至0.01g），至25mL比色管中，加入15mL0.2%乙酸水溶液（3.4），涡旋30s，超声提取20min，用0.2%乙酸水溶液（3.4）定容至25mL，涡旋混匀，转移至50mL离心管内，8000r/min离心10min，取上清液待净化。5.1.2净化HLB固相萃取小柱（3.5）预先用5mL甲醇（3.1.1）和5mL0.2%乙酸水溶液（3.4）进行活化，取10mL离心上清液（5.1.1）流经小柱，待上清液自然流尽后，用5mL0.2%乙酸水溶液（3.4）淋洗，用吸耳球吹出小柱中残留液体，加5mL甲醇（3.1.1）洗脱，收集洗脱液，采用氮气将洗脱液缓慢吹干，准确吸取2mL水溶解残渣，经0.22μm滤膜（3.6）过滤作为测定液，用液相色谱-串联质谱仪测定。5.2空白试验除不加试样外，均按5.1测定步骤进行。5.3仪器参考条件5.3.1液相色谱分离条件a）色谱柱：C18色谱柱，50mm×4.6mm（i.d.），1.8µm，或性能相当者。b）流动相：A：水，B：乙腈（3.1.2），梯度洗脱条件见表2。c）柱温：25℃。d）流速：0.3mL/min。e）进样量：20µL。表2梯度洗脱表时间（min）流动相A（%）流动相B（%）流速（mL/min）0.09550.31.09550.33.05950.35.05950.35.19550.38.09550.35.3.2质谱参考条件a）离子源：电喷雾离子源（ESI）。b）扫描方式：负离子扫描。c）干燥气：氮气，温度350℃，流速10L/min。d）雾化器：氮气，压力40psi。e）毛细管电压：4000V。f）检测方式：多反应监测（MRM）。g）质谱参数见表3。——20—表3舒巴坦的质谱参数化合物定性离子对m/z定量离子对m/z裂解电压V碰撞能量eV舒巴坦232.1140.1232.164.0232.1140.1704305.4标准曲线的制作取空白试样按照5.1步骤制备空白基质溶液，将标准工作溶液（3.3.2）用空白基质溶液逐级稀释得到所需浓度系列的标准溶液，按浓度从低到高依次经液相色谱-串联质谱测定，以定量离子的峰面积为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标，得标准工作曲线。舒巴坦的LC-MS/MS多反应监测质量色谱图参见附录A中的图A.1。5.5定性测定在相同试验条件下，试样中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在±2.5%之内；且试样中定性、定量离子的相对丰度比与浓度接近的标准溶液中对应的定性、定量离子的相对丰度比进行比较，若偏差不超过表4规定的范围，可判定为试样中含有对应的待测物。表4定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对丰度（%）＞50＞20—50＞10—20≤10允许偏差（%）±20±25±30±505.6定量测定本方法采用外标标准曲线法定量。以不同浓度的标准溶液浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，作标准曲线线性回归方程，以试样的峰面积与标准曲线比较定量。待测物的响应值均应在线性范围内。6结果计算试样中舒巴坦的含量由色谱数据处理软件或按式（1）计算获得：·····························（1）式中：X——试样中舒巴坦的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；C——试样中舒巴坦峰面积对应的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V——试样定容体积，单位为毫升（mL）；m——试样的质量，单位为克（g）；f——稀释倍数；计算结果保留三位有效数字。7精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。8其他本方法对原料乳和液态乳（酸奶除外）中舒巴坦的检测限为0.3μg/kg，定量限为1.0μg/kg。—21——附录A舒巴坦标准溶液LC-MS/MS多反应监测质量色谱图图A.1舒巴坦标准溶液LC-MS/MS多反应监测质量色谱图本方法负责起草单位：北京市食品安全监控和风险评估中心（国家食品质量安全监督检验中心）验证单位：大连市食品检验所、山东省食品药品检验研究院、辽宁省食品检验检测院、广州质量监督检测研究院、中国检验检疫科学研究院综合检测中心。主要起草人：史海良、潘红艳、边海涛、薛霞、刘家阳。总离子流图定量离子m/z140.1定性离子m/z64.0