农业农村部公告第232号 鸡组织中阿维拉霉素残留检测(试行)

鸡组织中阿维拉霉素残留检测（试行）液相色谱-串联质谱法1范围本标准规定了鸡组织中阿维拉霉素残留检测的制样和液相色谱-串联质谱法测定方法。本标准适用于鸡的肌肉、肝脏、肾脏及皮脂中二氯异苔酸（DIA）残留量的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修定版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理试料中残留的阿维拉霉素，用丙酮提取，氢氧化钠溶液水解，乙酸乙酯/甲基叔丁醚液液萃取，氧化铝固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱法检测，内标法定量。4试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的一级水。4.1阿维拉霉素残留标示物二氯异苔酸（DIA）对照品，纯度大于99%。4.2阿维拉霉素残留标示物内标DIA-d6对照品，纯度大于99%。4.3超纯水：由Milli-Q超纯水仪制取。4.4丙酮：色谱纯。4.5氢氧化钠。4.6磷酸。4.7乙酸乙酯：色谱纯。4.8甲基叔丁醚：色谱纯。4.9甲醇：色谱纯。4.10正己烷：色谱纯。4.11乙腈：色谱纯。4.12甲酸：色谱纯。4.13中性氧化铝固相萃取柱：1g/6mL。4.14滤膜：0.2μm。4.15阿维拉霉素标准储备液（1mg/mL）：准确称取含阿维拉霉素10mg的对照品，于10mL棕色容量瓶中，用丙酮溶解并稀释至刻度，配成浓度为1mg/mL的标准储备液。-20℃贮藏，有效期1个月。4.16DIA标准储备液（100μg/mL）：准确称取含DIA1mg的对照品，于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配成浓度为100μg/mL的标准储备液。-20℃贮藏，有效期8个月。4.17DIA-d6内标储备液（100μg/mL）：准确称取含DIA-d61mg的对照品，于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配成浓度为100μg/mL的标准储备液。-20℃贮藏，有效期8个月。4.18阿维拉霉素标准工作液（10μg/mL）：准确量取0.5mL阿维拉霉素标准储备液于50mL棕色容量瓶中，用丙酮稀释至刻度。-20℃贮藏，有效期1个月。4.19DIA标准工作液（10μg/mL）：准确量取1mLDIA标准储备液于10mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。-20℃贮藏，有效期8个月。4.20DIA-d6内标工作液（1μg/mL）：准确量取0.1mLDIA-d6内标储备液于10mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。-20℃贮藏，有效期8个月。5仪器和设备5.1超高效液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。5.2分析天平：感量0.00001g。5.3天平：感量0.01g。5.4组织匀浆机。5.5高速冷冻离心机。5.6涡旋混合器。5.7氮吹仪。5.8旋转蒸发仪。5.9固相萃取装置。6试样的制备与保存6.1试料的制备取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并使均质。——取均质的供试样品，作为供试试料。——取均质的空白样品，作为空白试料。——取均质的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。6.2试料的保存-20℃以下保存。7测定步骤7.1提取称取试料1（±0.02）g，置于50mL离心管中。加入4mL丙酮，摇15s，涡旋5min，6000转/min离心5min。取上清液于另一50mL离心管中。残渣加4mL丙酮，重复提取两次，合并提取液，10000转/min离心5min，取上清液60℃氮气吹干。用4mL1mol/LNaOH溶液溶解残余物，涡旋30s，70℃水浴2h。用约1mL磷酸调pH值至1，加入4mL乙酸乙酯/甲基叔丁醚（1:1），振摇15s，涡旋15s，6000转/min离心5min，收集上清液。残渣加4mL乙酸乙酯/甲基叔丁基醚（1:1）重复萃取两次，合并萃取液，加入1μg/mLDIA-d6内标工作液100μL混匀备用。7.2净化中性氧化铝柱用10mL乙酸乙酯活化，取备用液过柱，用5mL乙酸乙酯/甲基叔丁醚（1:1）清洗管壁后过柱，再分别用5mL正己烷、5mL乙酸乙酯、5mL甲醇洗涤，然后用7mL含5%甲酸的乙腈溶液洗脱三次。洗脱液于50℃旋转蒸发至干，用2mL甲醇复溶，涡旋1min，50℃氮气吹干，用甲醇-水（1:1）1mL复溶，涡旋1min，14000转/min离心20min，滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱测定。7.3基质匹配标准曲线的制备取7份空白样品，经提取净化后，加入适量的DIA和DIA-d6标准工作液制备基质匹配标准溶液，对应鸡肌肉样品中DIA的添加浓度为5、10、25、50、100、200、500μg/kg；对应鸡肝脏样品中DIA的添加浓度为5、10、50、150、300、600、1000μg/kg；对应鸡肾脏、鸡皮脂样品中DIA的添加浓度为5、10、50、100、200、400、1000μg/kg，供超高效液相色谱-串联质谱测定。以测得的DIA特征离子峰面积与DIA-d6特征离子峰面积之比作为纵坐标，对应的浓度为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程和相关系数。7.4测定7.4.1色谱参考条件色谱柱：C18，50mm×2.1mm，1.7μm或效能相当者。流动相：A相为0.1%甲酸溶液；B相为甲醇。流速：0.4mL/min。柱温：40℃。进样量：5µL。线性梯度洗脱：洗脱程序见表1。表1线性梯度洗脱条件时间（min）流速（mL/min）流动相A（%）流动相B（%）曲线7.4.2质谱参考条件离子源：电喷雾离子源。扫描方式：负离子扫描。检测方式：多反应监测。电离电压：0.8kV。源温：150℃。雾化温度：500℃。锥孔气流速：150L/h。雾化气流速：1000L/h。测试药物定性、定量离子对及对应的锥孔电压、碰撞能量见表2。表2DIA及其内标DIA-d6的定性、定量离子及锥孔电压、碰撞能量化合物定性离子对（m/z）锥孔电压（V）碰撞能量（eV）DIA248.9190.3a2420248.9205.32414DIA-d6254.9193.31620（a定量离子）7.5测定法7.5.1定性测定通过样品色谱图的保留时间与基质匹配标准溶液的保留时间、各色谱峰的特征离子与基质匹配标准溶液色谱峰的特征离子相对照定性。样品与基质匹配标准溶液的保留时间的相对偏差不大于2.5%；样品特征离子的相对丰度与基质匹配标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表3的规定，则可判断样品中存在相应的被测物。表3定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度50%20%至50%10%至20%≤10%允许的相对偏差±20%±25%±30%±50%7.5.2定量测定00.4901060.50.4901061.50.419962.00.419962.10.4901064.00.490106取试样溶液和相应的基质匹配标准溶液，按内标法定量，标准溶液及试样溶液中DIA的响应值均应在仪器检测的线性范围内。7.6空白试验除不加试料外，采用完全相同的步骤进行平行操作。8结果计算和表述鸡组织中阿维拉霉素残留标示物DIA的残留量按下式计算：单点校准：或基质匹配标准曲线校准：式中：X——试料中DIA的残留量，μg/kg；C——从标准曲线得到的DIA浓度，μg/L；Ai——试料溶液中DIA的峰面积；A’is——基质匹配标准溶液中DIA-d6的峰面积；Cs——基质匹配标准溶液中DIA的浓度，μg/L；Cis——试料溶液中DIA-d6的浓度，μg/L；Ais——试料溶液中DIA-d6的峰面积；As——基质匹配标准溶液中DIA的峰面积；C’is——基质匹配标准溶液中DIA-d6的浓度，μg/L；V——最终定容体积，mL；m——称样量，g；f——稀释倍数。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。9检测方法灵敏度、准确度和精密度9.1灵敏度本方法在鸡组织（肌肉、肝脏、肾脏、皮脂）中阿维拉霉素残留标示物DIA的检测限均为5µg/kg，定量限均为10µg/kg。9.2准确度本方法对鸡肌肉组织中阿维拉霉素残留标示物DIA在10µg/kg～400µg/kg添加浓度（对应阿维拉霉素添加浓度为56µg/kg～2240µg/kg）的回收率为70%～110%；对鸡肝脏组织中阿维拉霉素残留标示物DIA在10µg/kg～600µg/kg（对应阿维拉霉素添加浓度为56µg/kg～3360µg/kg）的回收率为70%～110%；对鸡肾脏组织中阿维拉霉素残留标示物DIA在10µg/kg～400µg/kg添加浓度（对应阿维拉霉素添加浓度为56µg/kg～2240µg/kg）的回收率为70%～110%；对鸡皮脂组织中阿维拉霉素残留标示物DIA在10µg/kg～400µg/kg（对应阿维拉霉素添加浓度为56µg/kg～2240µg/kg）的回收率为70%～110%。9.3精密度本方法的批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。附录A（资料性附录）图A1.1空白鸡肝脏样品特征离子质量色谱图图A1.2鸡肝脏基质匹配标准溶液特征离子质量色谱图（300μg/kg）图A1.3空白鸡肝脏添加试样特征离子质量色谱图（300μg/kg）