白喉棒状杆菌、溃疡棒状杆菌和假结核棒状杆菌的鉴定程序

白喉棒状杆菌、溃疡棒状杆菌和假结核棒状杆菌的鉴定程序IDENTIFICATIONOFCORYNEBACTERIUMDIPHTHERIAE,CORYNEBACTERIUMULCERANSANDCORNYNEBACTERIUMPSEUDOTUBERCULOSISISSUENO:2ISSUEDATE:03.02.06ISSUEDBY:StandardsUnit,EvaluationsandStandarsLaboratoryTranslatedCopy:复旦大学附属中山医院临床微生物中心本操作规程应当和HealthProtectionAgency的其它sop文件一起使用Email:[e-mail]:1of9索引索引………………………………………………………………………………….2修订程序…………………………………………………………………………….3本文件主要内容……………………………………………………………………..4介绍…………………………………………………………………………………..4毒素特征鉴定原则1安全事项…………………………………………………………………………..62目标菌株…………………………………………………………………………..63鉴定………………………………………………………………………………..74报告………………………………………………………………………………...95参考资料(略)ISSUENO:2ISSUEDATE:03.02.06ISSUEDBY:StandardsUnit,EvaluationsandStandarsLaboratoryTranslatedCopy:复旦大学附属中山医院临床微生物中心本操作规程应当和HealthProtectionAgency的其它sop文件一起使用Email:[e-mail]:2of9修订程序本文件检索标号BSOPID2本文件标题白喉棒状杆菌、溃疡棒状杆菌和假结核棒状杆菌的鉴定程序每一标准操作程序都有一个独立的修订记录.当前本文件的修订记录列在本页.每一份调整文件都由实验室的校对人员来更新.修订数/日期废弃的发行号插入的发行号页码涉及的章节修订2/03/02/20061.127811章节1章节3.3章节6从DHGreenBook参考表格内的试验步骤增加联系方式ISSUENO:2ISSUEDATE:03.02.06ISSUEDBY:StandardsUnit,EvaluationsandStandarsLaboratoryTranslatedCopy:复旦大学附属中山医院临床微生物中心本操作规程应当和HealthProtectionAgency的其它sop文件一起使用Email:[e-mail]:3of9白喉棒状杆菌、溃疡棒状杆菌和假结核棒状杆菌的鉴定程序文件主要内容:本sop介绍如何把咽喉、皮肤和其它部位的分离出来的棒状杆菌属鉴定到白喉棒状杆菌、溃疡棒状杆菌和假结核棒状杆菌种水平。这些细菌可以从临床典型咽部白喉或皮肤白喉以及其它少见的临床感染病例中分离到。并且重视由棒状杆菌属产生的毒素。介绍本sop介绍4种试验用于病原菌棒状菌属的初步鉴定，并且建议将这些病原菌送往上一级参考实验室进行确诊试验和毒素试验。对于那些不产生毒素的棒状杆菌属请参考BSOPID3－李斯特菌属、没有毒素棒状杆菌属和其它没有芽孢的革兰阳性杆菌鉴定。毒素2，3目前研究表明白喉棒状杆菌群包括：白喉棒状杆菌、假结核棒状杆菌和溃疡棒状杆菌。其中白喉棒状杆菌包括4中生物型：gravis，mitis，intermedium和belfanti。特征棒状杆菌属是革兰阳性杆菌，通常细菌末端呈棒状，菌体有时成单或成双。有些菌体染色不均匀呈珠状。所使用的培养基包括血和亚碲酸钾，比如Hoyle亚碲酸盐培养基是一种很好的选择性鉴别培养基。白喉棒状杆菌在Hoyle亚碲酸盐培养基培养16-18h后呈现极微小的灰色或黑色菌落，培养48h后产生特征性菌落。潜在的产毒型棒状杆菌株也可以在血平板上生长。不同菌株的菌落形态是不同的。溃疡棒状杆菌和假结核棒状杆菌可以在血平板上产生轻微的溶血。尽管白喉棒状杆菌可以在营养琼脂上生长，但加入血清或全血有利于提高它的生长速度。白喉棒状杆菌、假结核棒状杆菌和溃疡棒状杆菌是一种兼性厌氧，没有芽孢、没有荚膜，抗酸阴性的细菌。这些菌株没有动力，但触酶阳性。溃疡棒状杆菌和假结核棒状杆菌都是尿素阳性，这可以和白喉棒状杆菌区分。这些菌株内包含了phage－borne白喉毒素基因，可以产生毒素。毒素型的菌株可以引起白喉或白喉样的疾病。对于可能产毒素的棒状杆菌株应当尽快送往参考实验室进行毒素的检测。通过PCR来扩增白喉毒素基因上的亚组可以用来检测毒素基因（白喉毒素的结构基因），尽管不能确定一定产生毒素。ISSUENO:2ISSUEDATE:03.02.06ISSUEDBY:StandardsUnit,EvaluationsandStandarsLaboratoryTranslatedCopy:复旦大学附属中山医院临床微生物中心本操作规程应当和HealthProtectionAgency的其它sop文件一起使用Email:[e-mail]:4of9PCR是一种快速的试验，可以在接受到菌株后3-4小时内完成检测。毒素确诊试验还要结合毒素的表型试验。鉴定原则通过最初培养基上的菌落形态、革兰染色和4种初步试验可以在4个小时内初步鉴定产毒素型的棒状杆菌。附加的确诊试验需要使用商品化的试剂盒并结合毒素试验。建议将怀疑的菌株送往当地的CDC进行确诊试验和毒素检测。本SOP不建议使用Albert染色，因为异染颗粒不是特异性针对白喉棒状杆菌。ISSUENO:2ISSUEDATE:03.02.06ISSUEDBY:StandardsUnit,EvaluationsandStandarsLaboratoryTranslatedCopy:复旦大学附属中山医院临床微生物中心本操作规程应当和HealthProtectionAgency的其它sop文件一起使用Email:[e-mail]:5of91安全事项5-15白喉棒状杆菌属于生物危害2级怀疑白喉棒状杆菌的菌株需要在生物安全柜内处理.对于尿素试验认为使用尿素斜面比使用尿素液体培养基安全.白喉棒状可以引起严重疾病,有时可能是致命疾病.白喉的实验室获得性感染已经被报道。万古霉素是治疗白喉有效药物.实验室在处理过程中可能会产生气溶胶,所以必须使用生物安全柜.在运送时应当遵守邮政局的危险品运送手册2目标菌株可以产生毒素的棒状杆菌属白喉棒状杆菌生物亚型:belfanti白喉棒状杆菌生物亚型:gravis白喉棒状杆菌生物亚型:intermedius白喉棒状杆菌生物亚型:mitis假结核棒状杆菌溃疡棒状杆菌3鉴定3.1镜下形态革兰染色:革兰阳性杆菌、多型性、锥形或棒状的细菌末端略有弯曲。菌体单个或成双，时常呈“v”型。有些菌体染色微弱或不均匀，呈珠状。3.2最初的分离培养基血平板－皮肤拭子培养：5-10％CO235-37℃40-48h喉拭子培养：厌氧，35-37℃16-24hHoyle亚碲酸盐培养基：35-37℃16-48h注意：可能出现B溶血的链球菌，其实是咽拭标本。ISSUENO:2ISSUEDATE:03.02.06ISSUEDBY:StandardsUnit,EvaluationsandStandarsLaboratoryTranslatedCopy:复旦大学附属中山医院临床微生物中心本操作规程应当和HealthProtectionAgency的其它sop文件一起使用Email:[e-mail]:6of93.3试验步骤所有产毒素型棒状杆菌都是触酶阳性（见BSOPTP8-Catalasetest）并且吡嗪酰胺（pyrazinamide）*阴性。培养基生化试验白喉棒状杆菌生物型Hoyle’s亚碲酸盐培养基血培养基硝酸盐*尿素*白喉棒状杆菌gravis浑浊，灰色/黑色,透明菌落,直径1.5-2.0mm暗淡色表面,用接种还推动菌落,容易裂成小块,易碎.不溶血阳性阴性白喉棒状杆菌mitis灰色/黑色,透明菌落,直径1.5-2.0mm,边缘完整,平滑,菌落表面光滑;通常菌落大小不一菌落周围有微小的B溶血环阳性阴性白喉棒状杆菌intermedius小,灰色/黑色,菌落表面有光泽,分散的半透明菌落,直径0.5-1.0mm菌落周围有微小的B溶血环阳性阴性白喉棒状杆菌belfanti灰色/黑色,透明菌落,直径1.5-2.0mm,边缘完整,平滑,菌落表面光滑;通常菌落大小不一菌落周围有微小的B溶血环阴性阴性溃疡棒状杆菌灰色/黑色,非常干燥的透明菌落菌落周围有微小的B溶血环阴性阳性假结核棒状杆菌灰色/黑色,非常干燥的透明菌落菌落周围有微小的B溶血环阴性阳性*如果以上试验在4h后提示该菌株是白喉棒状杆菌或溃疡棒状杆菌或假结核棒状杆菌,请立即通知上级单位,并根据实验室安全手册进行隔离.ISSUENO:2ISSUEDATE:03.02.06ISSUEDBY:StandardsUnit,EvaluationsandStandarsLaboratoryTranslatedCopy:复旦大学附属中山医院临床微生物中心本操作规程应当和HealthProtectionAgency的其它sop文件一起使用Email:[e-mail]:7of9如果这些初步试验没有提示该菌株是白喉棒状杆菌或溃疡棒状杆菌或假结核棒状杆菌,可以根据临床指示再进行分离鉴定.使用商品化鉴定试剂盒或再做附加的生化试验,根据临床指示参考实验室安全手册进行分离.本表格只适用于本指南.3.4附加试验步骤如果初步鉴定认为该菌株可能是白喉棒状杆菌或其它的产毒素型棒状杆菌,需要尽快加做4h试验.4个4h初步试验后,所有菌株需要纯分血平板,并且接种Loeffler或血琼脂斜面(可能需要联系CDC参考实验室).如果初步试验结果提示有白喉棒状杆菌或溃疡棒状杆菌或假结核棒状杆菌.需要结合临床症状考虑结果.商品化鉴定试剂盒附加的生化/其它试验.3.5储存和传报如果考虑白喉棒状杆菌或溃疡棒状杆菌或假结核棒状杆菌存在,立即分离置Loeffler或血琼脂斜面送往参考实验室.ISSUENO:2ISSUEDATE:03.02.06ISSUEDBY:StandardsUnit,EvaluationsandStandarsLaboratoryTranslatedCopy:复旦大学附属中山医院临床微生物中心本操作规程应当和HealthProtectionAgency的其它sop文件一起使用Email:[e-mail]:8of94报告4.1初步鉴定根据细菌的生长特征、菌落形态、革兰染色、触酶、和4h试验结果证明。4.2需要做确诊试验根据毒素试验做确诊鉴定，并且报告4.3通知临床医生如果考虑或确诊为白喉棒状杆菌或溃疡棒状杆菌或假结核棒状杆菌存在。联系临床医生，并结合病人的其他信息•怀疑白喉•带有薄膜的咽头炎及扁桃体炎•皮肤溃疡并有海外旅游史•除了以上，还有精神上和心血管的临床表现•有农场工作或从事兽医•有美国东部、中欧、亚洲或非洲的旅游史4.4通知CDCISSUENO:2ISSUEDATE:03.02.06ISSUEDBY:StandardsUnit,EvaluationsandStandarsLaboratoryTranslatedCopy:复旦大学附属中山医院临床微生物中心本操作规程应当和HealthProtectionAgency的其它sop文件一起使用Email:[e-mail]:9of9