亲和层析

亲和层析Affinitychromatography第一节基本原理生物分子能够区分结构与性质非常相近的其他分子，选择性地与其中某一分子相结合。生物分子间的这种特异性相互作用称为生物亲和作用，通过亲和作用发生的结合称为亲和结合。利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为分离纯化技术，其代表为亲和层析法。3技术要点（1）找与底物专一可逆结合的配基；（2）将配基通过共价键偶联到基质；（3）配基与底物吸附；（4）洗脱目标物。技术要点：寻找可与底物(S)专一可逆结合的配基;将配基（L）通过共价键偶联到基质，并要求偶联后L与S的亲和力不变；L与S吸附并与杂质分离，将杂质洗出：洗脱目标物，即分离纯化。亲和层析的特点：1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子3、纯化倍数大，产物纯度高4、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件，应用受到一定的限制抗原与抗体DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA)酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子激素或药物与其受体具有特异性亲和作用的生物分子维生素与其特异性结合蛋白糖蛋白与其相应的植物凝集素7亲和吸附剂：载体—配基在亲和层析中起可逆结合的特异性物质称为配基（Ligand）。与配基结合的层析介质称为载体（Matrix）。8亲和层析的原理（1）配基固定化：配基与载体偶联，结合成具有特异亲和性的分离介质。（2）吸附样品：亲和层析介质选择性吸附生物活性物质.（3）样品解吸：选择适宜的条件使被吸附物活性物质解吸。一、基质（载体）的选择第二节亲和层析的基本操作载体在亲和层析中的作用是使配基固定化，同时提供了亲和对两物质特异性结合的空间环境。1.理想的基质应满足下面的要求第二节亲和层析的基本操作具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速具有惰性，尽量减少非专一性吸附具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共价和偶联在偶联、吸附和洗脱时，有较好的物理化学稳定性纤维素聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺－琼脂糖凝胶（ACA,Ultrogel）交联葡聚糖琼脂糖交联琼脂糖应用最多Sepharose4B多孔玻璃珠（CPG，Bio-Glass）其它新型载体2.基质种类二、配体（基）(ligand）的选择1、纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力2、亲和力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需的条件就要强烈，这样可能使生物分子变性3、配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与生物分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响配基与生物分子之间的亲和力131、配基的选择亲和层析配基的选用主要取决于分离对象。1、配基与配体有足够大的亲和力（亲和势），KL在10-4～10-8之间。2、配基与配体的结合应是专一的。3、配基应具有化学活性。14亲和势—KL（EL复合物的解离常数）152、配基的浓度对亲和势比较低的时候（KL≥10-4mol/L），增加配基浓度有利于吸附。增加亲和柱的长度来提高吸附率。配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。理想的配基浓度为1-10μmol/L。163、配基偶联的位置配基固定化时，其不参与亲和结合的部位与载体进行偶联。AMP-Sepharose亲和柱腺嘌呤N6-氨基接到载体上，对脱氢酶和甘油激酶有吸附力。磷酸基接到载体上，对甘油醛-3-磷酸脱氢酶有吸附力。174、配基分子的大小选用大分子配基。甘氨酸小分子物质作为配基，载体和配基间插入一个“手臂”以消除空间障碍。185、配基的类型较小的有机分子或天然生物活性物质。根据配基应用和性质:特殊配基和通用配基。特殊配基（specialligand）19通用配基（generalligand）用于一类物质的分离提纯。用NADH作脱氢酶类亲和层析的通用配基；用ATP作激酶类亲和层析的通用配基；用外源性凝集素作糖蛋白类亲和层析时的通用配基等。20三、载体的活化与偶联糖类载体的活化与偶联聚丙烯酰胺凝胶及其它凝胶衍生物活化与偶联用于固定化配基的凝胶衍生物21（一）、糖类载体活化与偶联溴化氰活化法高碘酸氧化法环氧化法甲苯磺酰氯法双功能试剂法22溴化氰活化法载体如琼脂糖、葡聚糖等，在碱性条件下用溴化氰处理，可引入活泼的“亚氨基碳酸”中间体。在弱碱的条件下直接与含有游离脂肪族氨基或芳香族氨基的配基偶联。23方法24高碘酸氧化法多糖载体与0.1mol/L的高碘酸钠氧化反应24小时会产生醛；在温和条件下，醛与赖氨酸上的ε-NH2生成西夫碱，接着用硼氢化钠还原，生成稳定的烷基胺。25环氧化法碱性条件下，多糖载体与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物；环氧化合物又与氨基酸或蛋白质上氨基偶联。26甲苯磺酰氯法甲苯磺酰氯法在无水丙酮中进行。优点：①活化反应迅速；②偶联条件温和；③偶联效率高。27双功能试剂法双功能试剂是同一分子中具有两个反应活性基团的化学试剂，常作为连接两个分子的“桥梁”。二乙烯砜、戊二醛、琥珀酸酐优点：反应速度快、条件温和，能与氨基、糖类、酚、醇类等偶联。28（二）、聚丙烯酰胺凝胶及其它凝胶衍生物活化与偶联叠氮化法重氮化法(含氨基载体)碳二亚胺缩合法（含羧基载体）29聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法有大量可修饰的酰胺基。酰胺基能被含氮化合物置换制备多种衍生物。30叠氮化法聚丙烯酰胺的酰肼衍生物，加1mol/L的亚硝酸，反应液搅90s；加入脂肪胺类配基，制得亲和吸附剂。31重氮化法ω-氨基烷基琼脂糖衍生物，对硝基苯甲酰氯反应，制得对硝基苯甲酰胺烷基琼脂糖衍生物。用连二亚硫酸钠还原，亚硝酸钠处理，得重氮盐衍生物。配基与重氮盐衍生物偶联，制得亲和层析柱。32碳二亚胺缩合法碳二亚胺为羧基活化剂。反应中的脲衍生物可用有机溶剂洗涤除去。33（三）、用于固定化配基的凝胶衍生物1、CNBr活化的Sepharose4BSepharose4B经CNBr活化，可偶联蛋白和核酸类配基。2、AH-Sepharose4B和CH-Sepharose4B含有6个碳原子的”手臂”的琼脂糖衍生物AH-Sepharose4B用于含有羧基的一类配基。CH-Sepharose4B能与含有一级氨基的配基偶联。34353、环氧活化型Sepharose6B由亲水“手臂”与Sepharose6B载体通过醚链形成的衍生物。用于小分子配基的固定化。用于偶联脂多糖、蛋白等大分子配基。364、活化型亲和胶10和15由N-羟琥珀酰亚胺与琼脂糖衍生物形成的活化酯。Affi-Gel10的“手臂”长为10个碳原子，产生一些负电荷，有利于碱性或中性蛋白偶联；Affi-Gel15为15个碳原子的“手臂”，产生一些正电荷，故有利于酸性蛋白的偶联。375、CM-生物胶A、亲和胶202和亲和胶102CMBio-GelA，无“手臂”的羧基衍生物；Affi-Gel102具有6个原子“手臂”，未端为氨基。Affi-Gel202具有10个原子的“手臂”，未端具有羧基；38四、影响吸附亲和力的几个因素KL配基浓度对亲和力的影响空间障碍的影响配基与载体的结合位点的影响载体孔径的影响微环境的影响39（一）、配基浓度对亲和力的影响为将亲和配体与其它物质分开，需要阻留值≥10。配基浓度与亲和对解离常数相关。对于低亲和力系统，配基浓度。40（二）、空间障碍的影响空间位阻。对于分子大的配体以及小分子配基更明显。“手臂”，增加与载体相连配基的活动度，减轻载体的立体障碍。常用的“手臂”多为烃链。41（三）、配基与载体的结合位点的影响多肽或蛋白质等大分子配基须控制偶联反应条件，使它以最少的功能基团与载体连接。保持蛋白质原有的高级结构，使亲和吸附剂具有较大的亲和力。42（四）、载体孔径的影响载体孔隙是配体向配基接近的通道。孔径大小对吸附剂亲和能力有影响。（五）、微环境的影响载体及“手臂”的电性、极性对亲和力的影响。避免引入离子键的基团。疏水作用的存在，会引起非特异性吸附作用。43五、亲和层析的吸附和洗脱影响吸附的条件亲和层析的洗脱亲和吸附剂的再生44（一）、影响吸附的条件亲和吸附剂及配体的性质缓冲液的种类、离子强度、pH、温度和层析流速有关。温度升高会使吸附作用减弱。流速每小时低于10ml/cm2。层析柱用前必须充分平衡。上样体积为柱床体积的5%。45非专一性吸附亲和层析中的非专一性吸附。离子效应疏水基团复合亲和力46离子效应配基与载体-间隔臂的不完全结合，将无关离子基团引入吸附剂。具有离子基团的亲和吸附剂会影响蛋白质的洗脱行为。47疏水基团吸附剂疏水性基团与蛋白质结构中的疏水区相互吸引，形成非专一性吸附。疏水基团：（1）长的烃链结构的“手臂”（2）疏水性配基48复合亲和力离子效应作用，又有疏水作用。配体与配基有较强生物特异性。用高浓度的盐和有机溶剂，以提高选择性。49（二）、亲和层析的洗脱洗脱方法主要有三种：非专一性洗脱特殊洗脱专一性洗脱1、非专一性洗脱化的配基对相应的生物大分子的亲和力降低非专一性洗脱剂的作用并不是使被吸附的生物大分子的构象发生变化，而是洗脱剂中的某一组分与固定配基形成复合物，使固定51非专一性洗脱改变洗脱剂的pH。离子强度的分步和梯度变化.亲和势很高，促溶离子，其洗脱能力的强弱顺序Cl－I－CF3COO－SCN－CCl3COO－。用蛋白质变性剂（如脲或盐酸胍）。亲和双方吸附能力很强，可以用专一的化学方法裂解配基与载实际上特殊性洗脱法也是一种非特异性洗脱方法2、特殊性洗脱体的连接键，获得的配基-蛋白络合物后，再除去配基。53特殊洗脱裂解配基与载体的连接键。断裂方法有：硫酯键用羟胺处理30分钟；偶氮键用连二亚硫酸钠硼酸缓冲液处理；二硫键用巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏糖醇等处理。使用特异的配基作为洗脱剂3、专一性洗脱使用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合来洗脱目标产物55专一性洗脱S（固定化配基），E（酶），I（游离配基）（1）竞争性效应，即ESI不如EI稳定，增加洗脱剂中I，会使E洗脱下来（正洗脱）。（2）当ESI稳定性与EI相同时，I的存在并不影响E对S的结合，非竞争性效应。（3）反竞争性效应，即ESI比EI稳定，I使E与S结合更紧密（负洗脱）。56反竞争性效应57亲和层析中配基的选择和洗脱条件58（三）、亲和吸附剂的再生用缓冲液充分平衡后即可重复使用。亲和力下降，非特异吸附增加，大多由变性蛋白沉积造成，用6mol/L脲洗柱。引入手臂在亲和层析中引入“手臂”示意图七、应用实例上样平衡洗脱亲和层析分离GST示意图