实时荧光定量PCR数据分析及常见问题分析

实时荧光定量PCR数据分析及常见问题分析一、数据分析定量PCR扩增曲线的各种概念一、数据分析什么是基线•基线是扩增曲线的水平部分。一、数据分析基线扣除一、数据分析什么是阈值•阈值是一个荧光强度值，穿过阈值与X轴平行的直线称为阈值线。一、数据分析什么是Ct值•Ct值是阈值线与扩增曲线的交点对应在X轴上的值。一、数据分析基线一、数据分析基线一、数据分析基线一、数据分析基线一、数据分析阈值线一、数据分析阈值线二、常见问题分析1、PCR扩增抑制（以Bio-CFX96为例）扩增曲线荧光强度大小及Ct值大小可提示存在抑制。H07存在扩增抑制；解决方法：将样本稀释后进行扩增。（抑制物的影响可通过稀释样本消除）二、常见问题分析PCR抑制物黑色素多糖类血红蛋白尿素其他乙醇蛋白酶K胍盐苯酚二、常见问题分析血液中PCR抑制物的作用机制及对策抑制物作用原理对策肝素可结合于DNA和RNA上；对反转录酶和聚合酶有抑制作用。肝素酶或氯化锂血红蛋白含有铁，释放铁离子至PCR混合物，干扰DNA合成。1）DNA-琼浆糖凝胶珠的相互混合；2）加入0.6%（wt/vol）的BSA（牛血清白蛋白）；3）NaOH处理。乳铁蛋白含有铁，释放铁离子至PCR混合物，干扰DNA合成。同上免疫球蛋白IgG与单链DNA相互作用同上亚铁血红素与DNA、RNA结合，后续的提取过程中不能被去除；抑制聚合酶活性。加BSA，结合亚铁血红素二、常见问题分析检查样本质量•用分光光度计测量样本260/280比值•DNA纯度：OD260/OD280=1.8•RNA纯度：OD260/OD280=2.0二、常见问题分析2、自动基线有问题二、常见问题分析手动设置基线•点击右键，选择BaselineThreshold二、常见问题分析手动设置基线•将BaselineEnd设置为“扩增信号出现的前一个循环”•即，原始为26，将其设置为20，点击OK二、常见问题分析手动设置基线•设置完成后问题曲线恢复正常二、常见问题分析3、重复性1个样本4个复孔重复性好二、常见问题分析3、重复性1个样本4个复孔重复性差二、常见问题分析造成重复性差的原因•基线、阈值的设置•加样误差（操作？移液器？）•没有将试剂和样本充分混匀•低拷贝的样本→泊松分布•没有使用ROX校准（ABI7500）二、常见问题分析基线、阈值的设置•根据曲线的具体情况进行设置：阈值：大部分曲线荧光强度/20基线：开始→2/3（根据仪器和试剂）结束→扩增信号出现的前一个循环•如果基线、阈值设置无问题，则是其它原因造成重复性差。二、常见问题分析加样误差（操作？移液器？）没有将试剂和样本充分混匀•有时候在制备PCR反应混合液时（包括Goldstar/PCRMix反应液、引物探针、样本、水），在分装入反应板（管）前没有充分混匀。•结果加入到每个孔中的试剂成分就有所不同。•解决方法：•在分装反应混合液前，要将其充分混匀（振荡、吹打）离心。•同时上机之前，要将PCR反应板（管）离心，使所有液体都在反应管底部。二、常见问题分析低拷贝的样本→泊松分布•泊松分布：是一种统计与概率学里常见到的离散机率分布（discreteprobabilitydistribution）。•在30ul中有9个模板，每个反应管均匀的分配到3个模板的几率有多高？如果30ul中有9000个模板呢，又会怎么样？二、常见问题分析ROX校准：参比荧光（ABI7500）二、常见问题分析ROX设置•ABI7500仪器软件自动进行ROX校准。•ROX校准为可选步骤，如果使用的PCR试剂没有添加ROX参比荧光，或者ROX添加浓度不适合，请将ROX校准关闭（None）。二、常见问题分析4、“可疑的”扩增曲线（以ABI7500为例）•由于PCR扩增形成的真正的扩增曲线通常很容易确认。•有特征的形状：首先有背景信号（基线期），然后是三个增长阶段（指数增长期、线性增长期和平台期）二、常见问题分析指数增长期内扩增曲线具有高度重复性二、常见问题分析是什么原因造成平台期很低呢？•可能是目标样本的浓度太低。•通常如果模板的起始浓度太低，反应体系中会形成大量的引物二聚体。•大量引物二聚体的形成使得引物很快消耗完，从而造成扩增曲线的平台期很低。二、常见问题分析引物和模板比例二、常见问题分析是否可以调整引物和模板的比例？•YES。•低引物浓度会导致高Ct值（灵敏度低）。•所以对于低浓度的样本，反应体系中引物的浓度却不能太低。二、常见问题分析如何判断他们是否存在扩增？•首先看对数图谱，和同一反应中的其它曲线相比，这些曲线的形状不相同。二、常见问题分析如何判断他们是否存在扩增？•同时这些曲线没有明显的指数增长期。二、常见问题分析如何判断他们是否存在扩增？•最后看线性图谱。•曲线一直没有上升的趋势，提示不存在扩增。二、常见问题分析如何判断他们是否存在扩增？•案例：先看对数图谱右侧的曲线形状和扩增曲线很相似，但曲线不光滑。二、常见问题分析如何判断他们是否存在扩增？•案例：再看下线性图谱，可以看到曲线有一定的上升。二、常见问题分析如何判断他们是否存在扩增？•案例：•分析：•形成这类曲线的原因可能是模板可能是模板的质量差（PCR抑制物；模板浓度低），也有可能是引物探针有问题。•试剂原因：•如果使用的试剂背景信号太强，荧光的增长将会很小，导致扩增曲线的指数增长期会变得很短，或者没有。•荧光信号差的试剂也会有同样的问题。二、常见问题分析总结对PCR原理的了解是基础，一切从原理出发。常见问题归类：•抑制物：稀释样本消除抑制•重复性差：基线/阈值设置、加样/混匀、泊松分布、参比荧光•可疑的扩增：综合各种图谱分析