HE染色protocol

常规HE染色石蜡包埋的组织切片必须经过脱蜡水洗处理才能染色，让水溶性染料渗入组织中，含蜡的组织切片无法进行任何染色。所以，在染色前必须用二甲苯或替换剂进行彻底脱蜡，经过乙醇洗后，再用水洗。即石蜡组织切片→二甲苯→乙醇（无水乙醇，95%，80%）→水。人们通常把这个过程叫做切片脱蜡至水。脱蜡至水是染色前的必须完成的基本步骤。一般脱蜡至水的时间和步骤如下：HE染色脱蜡至水步骤步骤顺序试剂时间1二甲苯Ⅰ脱蜡5min2二甲苯Ⅱ脱蜡5min3二甲苯Ⅲ脱蜡5min4无水乙醇浸洗1min595%乙醇Ⅰ浸洗1min695%乙醇Ⅱ浸洗1min780%乙醇浸洗1min8自来水冲洗3-5min冰冻切片和细胞涂片样品的染色不需要经过脱蜡至水步骤，水洗后直接用苏木精和伊红染色。染色是利用染料的不同作用，使组织与染料以不同方式进行结合。常规染色是苏木精和伊红染色（H.E）。特殊染色（specialstains）和组织化学（免役组织化学）染色是根据诊断的需要对组织中的某些成分进行非常规的染色。HE染色用的苏木精是一种树木苏木的一种氧化产品，因为这种树非常罕见，多数氧化苏木精是合成品。苏木精必须氧化成熟后才能使用。苏木精染液需要预先配制，放置几个月自然氧化成熟。或购买成熟过的商品苏木精，也可在苏木精液中加一些成熟剂。苏木精本身对组织没有染色作用，需要“媒染剂”与组织连接，媒染剂是铁，铝，钨等由这类正离子金属提供。矾也是苏木精常用的媒染剂，如Harris苏木精的配制以硫酸铝钾（钾明矾）或铵明矾作为媒染剂。不同媒染剂配制的苏木精染色强度不同。苏木精作为一种基础染料对细胞核的核酸具有一定的亲和力。苏木精不是“退行性”就是“进行性”染色，退行性染色是把切片在染液内留一段时间，然后从染液里出来用盐酸乙醇分化，去除过染的一部分。这种方法最适合大批量的染色。进行性染色切片在染液中染到自己想要得染色强度。如冰冻染色。冰冻染色比较简单，但染色质量不如成批处理的好。伊红是一种酸性染料，和细胞的胞浆成分具有亲合力。有各种合成的伊红可共使用，它们的颜色各异，但作用都一样。在实验室中伊红比苏木精更稳定，伊红很少发生染色问题。唯一可以见到的问题是过染（overstaining），尤其是脱钙组织。苏木精液配制Harris苏木精液苏木精1g无水酒精10ml硫酸铝钾或硫酸铝铵20g蒸馏水200ml先将苏木精溶于酒精，再将矾放进蒸馏水中，把苏木精液与矾液混合后，电炉加热溶解，待到煮沸后离开电炉，稍候片刻慢慢加入氧化汞0.5g。然后使液体迅速冷却，过滤后使用，使用前每100ml苏木精加入冰醋酸4ml或改良明矾苏木精液A液苏木精2g95或100%乙醇20ml加热溶解。B液硫酸铝钾16g加热溶解后加入蒸馏水300ml冷却后加入A液，然后加入碘酸钠（准确称量）200mg搅拌三次，每次5分钟，30分钟后加冰醋酸10ml即可使用。新配制的苏木精染色时间2分钟。注意事项：1．切片脱蜡至水后先用蒸馏水洗再入苏木精染色。2．使用一周后苏木精会变蓝一些，这时可往液苏木精液中加2-10ml冰醋酸，过滤后使用。Mayer苏木精明矾液10%苏木精乙醇掖10ml碘化钠0.2g钾明矾或铵矾50g水合氯醛50g枸橼酸1g蒸馏水1000ml用蒸馏水溶解固体然后加入苏木精液。伊红水溶液配制伊红水溶液伊红Y0.5g蒸馏水100ml先用少量蒸馏水溶解伊红，再用玻璃棒搅拌溶解，完全溶解后加入剩余的蒸馏水。苏木精染色后分化需要的液体盐酸乙醇液配制盐酸乙醇液75%乙醇0100ml浓盐酸0.5ml苏木精染色后蓝化需要的液体目的（PURPOSE）Tobeusedforbluingthehematoxylinstain,followsthedecoloration,acidrinse,inregressivestaining..蓝化液（BLUINGSOLUTIONS）1Scott’sTapWater/Bluing硫酸镁（MgSO4）30g碳酸氢钠2g自来水3000ml充分混合，标记液体日期。推荐用于Gill’sⅢ苏木精蓝化。20.05%碳酸锂碳酸锂0.5g蒸馏水1000ml充分混合，标记液体日期。3氨水氢氧化铵5ml蒸馏水1000ml充分混合，标记液体日期。对事先冻存过的组织会引起脱片。水蓝化自来水流水冲洗10-30min手工HE染色方法和步骤石蜡切片必须经过脱蜡至水。冰冻切片先经过电吹风吹干，再用冰冻固定液短时间固定，不用经过脱蜡至水直接用自来水冲洗后进行染色。染色步骤参考表染色步骤1组织切片脱蜡至水2Harris苏木精液3～5min3自来水洗1min475%盐酸乙醇液分化数秒钟5自来水流水冲洗10min至细胞核呈蓝色，也可以使用蓝化液返蓝60.5%伊红水溶液1min795%乙醇Ⅰ脱水1min895%乙醇Ⅱ脱水1min9无水乙醇Ⅰ脱水1min10无水乙醇Ⅱ脱水1min11二甲苯Ⅰ透明1min12二甲苯Ⅱ透明1min13中性树胶或DPX封固结果细胞核蓝色，细胞浆红色，背景粉红色。自动染色机染色方法和步骤ShandonVarislainGemini自动染色机使用方法1.ShandonVarislainGemini自动染色机染色机有26个试剂槽，6个冲洗水位，5个干燥储存位，附载玻片框、水洗管、碳过滤器等。可以编制多个染色程序，根据染色机操作菜单编制常用的染色程序，所有准备工作完成后运行染色程序。2.准备常用的染液和试剂①二甲苯②75%乙醇③95%乙醇④无水乙醇⑤Mayers苏木精⑥0.5%伊红水溶液⑦1%盐酸乙醇3.编制常规HE染色程序HE染色程序参考表项目试剂时间脱蜡二甲苯Ⅰ10min二甲苯Ⅱ10min乙醇洗涤无水乙醇Ⅰ2min无水乙醇Ⅱ2min95%乙醇1min75%乙醇1min流水冲洗（搅拌）1min苏木精染色Mayer苏木精10min流水冲洗1min分化1%盐酸乙醇10s流水冲洗（搅拌）20min伊红染色0.5%伊红水溶液1min流水冲洗(搅拌)1min脱水95%乙醇Ⅰ30s95%乙醇Ⅱ30s无水乙醇Ⅰ2min无水乙醇Ⅱ2min透明二甲苯Ⅰ2min二甲苯Ⅱ2min使用说明①并根据显示器上的提示在相应试剂槽中加入需要的染液和试剂,每种约300ml。②石蜡切片80℃烤片，20分钟。将切片放入装载玻片框里置染色机中。选择染色程序。③染色机可以显示染色程序的运行情况，主要信息包括染色开始时间和染色结束时间及染色运行状况等，如果染色程序出现错误，可以随时终止运行。④染色质量的控制，据中国医科大学使用情况统计，300ml苏木精染色1500-1800张；300ml伊红水溶液染色2500-2800张；300ml其他试剂约处理800-1000张。需要更换新液。以便保证染色质量。⑤温度低于15℃染色效果不佳。应该调整室温。⑥因为染色用的试剂多为易燃品，染色机应远离火源。⑦进水孔要保持通常，需要定时进行清洗。定时更换碳过滤器。⑧染色完成后机器会发出提示声音。⑨片按常规中性树胶封片。4.细胞学涂片HE染色程序细胞学涂片HE染色程序参考表项目试剂时间固定95%乙醇10min流水冲洗（搅拌）1min苏木精染色Mayer苏木精10min流水冲洗1min分化1%盐酸乙醇10s流水冲洗（搅拌）20min伊红染色0.5%伊红水溶液1min流水冲洗(搅拌)1min脱水95%乙醇Ⅰ30s95%乙醇Ⅱ30s无水乙醇Ⅰ2min无水乙醇Ⅱ2min透明二甲苯Ⅰ2min二甲苯Ⅱ2min使用说明①染色完成后机器会发出提示声音。②取出切片按常规中性树胶封片。二封片切片染色后必须先通过80%、95%和无水系列乙醇脱水，然后经过透明剂透明。透明完成后在有组织的地方加上中性树胶或DPX，然后用清洁后盖玻片覆盖在组织上。人们通常把这个过程叫做封片。从市场上购买的盖玻片一般没有经过清洗，须要清洗处理后才能使用。根据组织的大小选用。盖玻片规格参考下表规格包装厚度18*18mm100片/合10合/包600合/箱0.13-0.17mm20*20mm100片/合10合/包600合/箱0.13-0.17mm22*22mm100片/合10合/包600合/箱0.13-0.17mm24*24mm100片/合10合/包600合/箱0.13-0.17mm24*32mm100片/合10合/包400合/箱0.13-0.17mm24*50mm100片/合10合/包400合/箱0.13-0.17mm盖玻片清洗处理的方法和步骤玻璃器皿清洁液配制用途：主要用于玻璃器皿的清洁。设备：4000ml长颈瓶，磁棒，磁力搅拌器6～7升盖着玻璃容器（瓷罐）试剂：酸清洁液：重络酸钾400g，蒸馏水4000ml，硫酸400ml。用水溶解重络酸钾，把重络酸钾液倒入瓷罐中，慢慢加入硫酸使液体变为棕黑色，按照使用，标明开始使用日期。注意：酸。有腐蚀性，致癌剂。安全措施：戴胶手套，防护眼镜，穿工作服。把硫酸慢慢加到液体里，在通风好的地方操作。硫酸：烟雾吸入会有害，影响器官皮肤，呼吸器官，生殖系统和胎儿组织。刺激皮肤眼睛和呼吸道。使用硫酸时操作应特别注意，硫要慢慢地加入液体里。盖玻片清洗步骤1．拆开盖玻片的包装将盖玻片浸泡于清洁液中4小时。2．将清洁液回收到玻璃容器中，用自来水充分冲洗盖玻片，直到没有颜色为止。3．用蒸馏水洗5-10次晾干或放于烤箱中烤干备用。盐酸酸玻璃器皿漂洗液：蒸馏水985ml，盐酸15ml，混合好，标签注明。注意：酸，有腐蚀性。安全措施：戴胶手套，防护眼镜，穿工作服。把酸加到水中，在通风好的地方操作。盐酸：强烈刺激皮肤，眼睛和呼吸道。经过吸收影响目标器官皮肤，呼吸道，生殖和胎儿系统。有腐蚀性。清洗步骤：1．倒入玻璃器皿，放置2～5min。2．用蒸馏水漂洗10次。3．必要时烤干后使用。常规染色常用的封片剂有DPX、中性树胶（人工合成）和加拿大树胶，可以任选一种。透明后即可从二甲苯中取出来进行封片，切片应在二甲苯透明状态下滴加封片胶，盖上适当大小的盖玻片。组织不要晾干了以后再加胶封片。组织在空气中晾干或烤箱烤干再进行封片，即“干封”，切片晾干了以后封片透明效果肯定不如“湿封”好，因为空气中不但有灰尘还含有水分，空气干燥时对封片影响较小，如果环境潮湿空气中水分较多，“干封”难免不受空气中水分的影响。因为二甲苯不会溶于水，可以隔离空气中的水分，二甲苯挥发后组织和空气直接接触。水分随着空气可以进入组织中，并封闭在组织里，所以，气候潮湿的地方应该避免封片时采用“干封”。封片胶以二甲苯作为溶剂，二甲苯非常容易挥发，如果器密封不紧二甲苯容易挥发，二甲苯挥发后封片胶会变稠。封片胶太稠，封片胶不容易向周围渗透，容易潴留气泡，有气泡的地方显微镜下看不清楚，时间久了气泡下面的组织还会退色。所以封片胶稠度要合适，外观类似蛋清或甘油的状态比较合适。如果封片胶变稠可适当加一些二甲苯，混匀后呈甘油状再使用。胶太稀也不利于封片，胶的粘稠度会降低，刚刚封固的切片稍倾斜时盖玻片很容易溜掉，甚至脱离封固组织的。会产生较大的气泡，二甲苯挥发后组织会裸露。切片放一段时间之后，盖玻片下会出现较大面积不透明的无胶区，有胶的地方组织呈透明状，没有胶的地方组织模糊不清，这种无胶区和气泡一样显微镜下同样看不清楚。多数原因是在胶中加入的二甲苯太多，遇到这种情况时只要让二甲苯自然挥发一段时间，胶的稠度就会变的合适，防止灰尘进入胶的中。封片时加胶的量要适当，不能太多或太少。胶太少组织不能完全被覆盖。太多会在盖玻片周边溢出来，胶太多干的也就慢，胶在未干之前很容易粘染污渍，不但影响切片的美观，甚至还会影响显微镜检查。以0.5ⅹ1cm大小的组织滴加1滴约25-50微升比较合适。恰当的封固才能有效地保护切片上的组织，延长组织切片的保存时间，为诊断和研究工作提供良好的档案资料。虽然工作简单，同样需要技术人员认真对待。另外，人们认为“干封”会减少二甲苯对人的毒害作用，本人认为既要保证质量，又不违背操作常规。为了避免二甲苯毒害作用，最有效的办法采用良好防护设备或选择合适的代用品。