乳酸菌的分离和初步鉴定

乳酸菌的分离和初步鉴定刘海音张超(长春师范学院生物系，长春，130032)摘要：本文采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选乳酸菌，经过连续6次以上的传代，以达到分离提纯，镜检时观察到链球状和杆状两种形状。为了鉴定分离出的菌种，做了一系列的生理生化反应实验，如吲哚试验的反应结果为阴性，糖发酵试验的反应结果为阳性。此外还进一步做了小型发酵实验，检测出了乳酸的存在⑴。以上实验结果符合乳酸菌的特征，从而证实该分离出的菌种为乳酸菌，杆状的叫做短乳杆菌，链球状的叫做乳链球菌。关键词：乳酸菌分离鉴定乳酸菌为一群可发酵碳水化合物以获取能量，并生成大量乳酸的一类细菌的总称。利用发酵技术保藏食品，最典型的是通过乳酸菌的发酵。这在发酵乳工业中已经得到广泛的应用。利用天然的或经筛选的乳酸菌发酵，已经生产出多种不同类型的发酵乳。因而分离和鉴定乳酸菌对人类的生产和生活都具有非常重要的意义。本报告采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选和分离乳酸菌，利用镜检观察到了链球状和杆状两种形状。通过吲哚试验和糖发酵试验以及小型发酵实验证明该菌种为乳酸菌，杆状的叫做短乳杆菌，链球状的叫做乳链球菌1.材料和方法1.1材料1.1.1选用沈阳乳业有限责任公司乳品一厂生产的辉山纯酸奶1.1.2培养基BCG牛乳培养基A(溶液)：脱脂奶粉100g,水500ml,加入1.6%溴甲酚绿（B.C.G）乙醇溶液1ml,80摄氏度灭菌20min.B(溶液)：酵母膏10g,水500ml,琼脂20g,PH:6.8121摄氏度灭菌20min以无菌操作趁热将A,B溶液混合均匀后倒平板。乳酸菌培养基牛肉膏5g,酵母膏5g,蛋白胨10g,葡萄糖10g,乳糖5g,氯化钠5g,水1000ml,PH:6.8121摄氏度湿热灭菌20min蛋白胨水培养基蛋白胨10g,氯化钠5g,水1000ml,PH:7.2~7.4121摄氏度湿热灭菌20min糖发酵培养基蛋白胨水培养基1000ml,1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1~2ml,PH:7.6,另配20%糖溶液（葡萄糖，蔗糖）各10ml.制法：1）.将上述含指示剂的蛋白胨水培养基（PH:7.6）分装于试管中，在每管内放一倒置的小玻璃管（Durhemtube）,使充满培养液。2）.将已分装好的蛋白胨水培养基和20%的各种糖溶液分别灭菌，蛋白胨水培养基121摄氏度灭菌20min,糖溶液112摄氏度灭菌30min.3).灭菌后，每管以无菌操作分别加入20%的糖溶液0.5ml,则成1%的浓度。1.1.3有关溶液1.6%溴甲酚紫乙醇溶液：溴甲酚紫1.6g溶于100ml乙醇中，贮存于棕色瓶中保存备用。吲哚试剂：对二甲基氨基苯甲醛8g,95%乙醇760ml,浓盐酸160ml.10%硫酸2%高锰酸钾含氨的硝酸盐溶液：称取硝酸银2g,蒸馏水100ml,待硝酸银溶解后，取出10ml备用，向其余的90ml硝酸银中滴加氨水，即可形成很厚的沉淀，继续滴加氨水至沉淀刚刚溶解成为澄清溶液为止，再将备用的硝酸银慢慢滴入，则溶液出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状的沉淀又消失，继续滴入硝酸银，直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。1.2方法1.2.1乳酸菌的分离提纯直接用接种环蘸取纯酸奶平板划线分离，置40摄氏度培养48小时。挑选出乳酸菌进行连续6次以上的传代，以达到提纯。1.2.2乳酸菌的鉴定吲哚试验1）.试管标记：取装有蛋白胨水培养基的试管2支，分别标记乳酸菌和空白对照。2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔到标记乳酸菌的试管中，标记有空白对照的不接种，置37摄氏度恒温箱中培养24~48小时。3）.观察记录：在培养基中加入乙醚1~2ml,经充分振荡，使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5~10滴吲哚试剂，如有吲哚存在，乙醚层呈玫瑰色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。糖发酵试验1）.试管标记：取分别装有葡萄糖，蔗糖发酵培养液试管各2支，每种糖发酵试管中分别标记乳酸菌和空白对照。2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。将装有培养液的杜氏小管倒置试管中，置37摄氏度恒温培养箱中培养24小时，观察结果。3）.观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原由颜色，其反映结果为阴性；如果培养液呈黄色，反映结果为阳性。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，杜氏小管内没有气泡为阴性反应。1.2.3乳酸的检测选用已经分离的菌种做小型发酵实验，取发酵液的上清液约10ml于试管中，加入10%硫酸1ml,再加2%高锰酸钾1ml,此时乳酸转化为乙醛，把事先在含氨的硝酸银溶液中侵泡的滤纸条搭在试管口中，微火加热试管至沸，观察滤纸变化。2.结果和分析2.1乳酸菌的分离提纯在平板上出现了圆形稍扁平的黄色菌落，周围培养基变为黄色，初步定为乳酸菌⑴，取出少量在显微镜下观察到了链球状和杆状两种形状（如图一）（图一）2.2乳酸菌的鉴定该菌种的菌落为圆形稍扁平的黄色菌落，有杆状和链球状两种形状。在吲哚试验中，加入菌种的试管无任何变化，证明为阴性反应（如图二）。（图二）说明该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的能力。也说明此菌种不是大肠杆菌，因为大肠杆菌的吲哚试验证明为阳性。在糖发酵试验中，在加入葡萄糖的发酵培养液中加入菌种后，培养液变为黄色，反应结果为阳性，且杜氏小管内无气泡（如图三）；（图三）加入蔗糖的发酵培养液中加入菌种后的反应结果也为阳性且杜氏小管内无气泡（如图四）。（图四）证明该菌种能分解葡萄糖和蔗糖而产酸。杜氏小管内没有气泡，说明该菌种分解糖后不产气。也证明此菌种不是大肠杆菌，因为如果是大肠杆菌除了产酸反应结果为阳性外，而且杜氏小管内会有气泡，因为大肠杆菌具有分解葡萄糖和蔗糖产酸并产气的能力。为了进一步鉴定该菌种，还做了小型发酵实验，通过滤纸条变黑，说明有乳酸存在（如图五）（图五）因为在发酵液的上清液中加入10%硫酸1ml和2%高锰酸钾1ml后，此时上清液中的乳酸转化为乙醛，加热后使乙醛挥发，因此使滤纸条变黑⑴。以上种种特征均符合乳酸菌的特征。杆状的即为乳酸菌中的短乳杆菌，链球状的即为乳酸菌中的乳链球菌。3.讨论通过对菌落特征，菌体细胞形态以及该菌的生理生化反应实验和运用该菌种做小型发酵实验，证实了该菌种为乳酸菌。杆状的即为短乳杆菌，链球状的即为乳链球菌。实验证明：用BCG牛乳琼脂培养基易于得到乳酸菌。为了高效分离筛选乳酸菌，应该注意挑取具有典型特征的黄色菌落。另外，在吲哚试验中，为了保证实验的准确性，在加入吲哚试剂后切勿摇动试管，这样乙醚层就不至于被破坏。在糖发酵试验中，应该在灭菌时适当延长煮沸时间，这样可以防止倒置杜氏小管内有残留气泡。注意了上述几点有利于实验的成功性。此外随着现代科学技术的不断发展，对菌种的鉴定也逐渐应用了分子生物学手段，但由于本实验室条件有限，不能做这个方面的实验。如有条件，可以做测定DNA的G+C含量，限制性片段长度多态性分析（RFLP）,随机扩增DNA多态性分析（RAPD）等等，这样就能更精确地鉴定该菌种。参考文献（1）.黄秀梨，夏立秋等.微生物学实验指导.北京：高等教育出版社；德国：施普林格出版社，1996，6：39~60（2）.沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验（三版）北京：高等教育出版社，1996，6：119~120（3）.东秀珠，蔡妙英等编著.常见细菌系统鉴定手册.北京：科学出版社，2001，2：289~294；399~412